Вскрытие и монтаж эксплантов мозга личинок плодовой мухи

Аннотация

Источник: Sheng, C., et al. Покадровая визуализация в реальном времени и количественная оценка быстрой динамики дендритной ветви в развивающихся нейронах дрозофилы. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует вскрытие и монтаж мозговых эксплантов личинок дрозофилы. Центральная нервная система (ЦНС), прикрепленная к глазным дискам, извлекается из личинок, а затем помещается на предметное стекло в физиологический раствор.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Препарирование и монтаж личиночных эксплантов мозга

1. Препарировать мозг личинок в физиологическом растворе наружного раствора (120 мМ NaCl, 4 мМ MgCl₂, 3 мМ KCl, 10 мМ NaHCO₃, 10 мМ глюкозы, 10 мМ сахарозы, 5 мМ N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ТЭС), 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES), 2 мМ Ca²⁺, pH 7,2) под микроскопом для вскрытия (4,5-кратное увеличение) двумя парами стандартных щипцов для рассечения наконечника #5 (11 см). Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать тело личинки на месте, а другую — для тщательного вскрытия мозга. Сохраните диски глаза, доли мозга и вентральный нервный канатик. Удалите прикрепленные мышцы, чтобы свести к минимуму движения образца во время визуализации.
2. Подготовьте предметное стекло (25 х 75 х 1,0 мм³) и с помощью шприца нарисуйте квадратную камеру вакуумной смазкой.
3. Добавьте 20 мкл наружного солевого раствора в квадратную камеру с жирозащитными барьерами.
4. Перенесите рассеченные мозги личинок в камеру на предметном стекле с помощью щипцов. Отрегулируйте положение мозга под эндоскопом для вскрытия, чтобы спинная сторона была обращена вверх.
5. Накройте камеру стеклянной крышкой (22 x 22 x 0,15 мм³). Теперь мозг личинки установлен на предметном стекле в камере, заполненной наружным физиологическим раствором (рис. 1B).
   заметка: Легкое нажатие на покровное стекло ограничивает мозг и уменьшает дрейф образца во время последующего сеанса визуализации.

Результаты

Рисунок 1: Рабочий процесс протокола визуализации и количественной оценки динамики дендритов. (A) Протокол содержит шесть этапов, охватывающих подготовку образцов, сбор изображений, обработку изображений и полуавтоматическую количественную оценку динамики дендритов. (B) Принципиальная схема, иллюстрирующая камеру визуализации, содержащую эксплант мозга личинки, ус...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Консистентная смазка для высокого вакуума	Индекс Dow Corning	79751-30
Защитное стекло микроскопа	Научный центр Фишера	12-544-Е
Предметные стекла для микроскопа Superfrost Plus	Научный центр Фишера	Телефонный номер 12-550-15
Реагентов
глюкоза
ХЕПЕС
KCl
MgCl2
NaCl
НаОГС3
ПБС
сахароза
ТЭС