Вскрытие и монтаж эксплантов мозга личинок плодовой мухи

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Препарирование и монтаж личиночных эксплантов мозга

1. Препарировать мозг личинок в физиологическом растворе наружного раствора (120 мМ NaCl, 4 мМ MgCl₂, 3 мМ KCl, 10 мМ NaHCO₃, 10 мМ глюкозы, 10 мМ сахарозы, 5 мМ N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ТЭС), 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES), 2 мМ Ca²⁺, pH 7,2) под микроскопом для вскрытия (4,5-кратное увеличение) двумя парами стандартных щипцов для рассечения наконечника #5 (11 см). Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать тело личинки на месте, а другую — для тщательного вскрытия мозга. Сохраните диски глаза, доли мозга и вентральный нервный канатик. Удалите прикрепленные мышцы, чтобы свести к минимуму движения образца во время визуализации.
2. Подготовьте предметное стекло (25 х 75 х 1,0 мм³) и с помощью шприца нарисуйте квадратную камеру вакуумной смазкой.
3. Добавьте 20 мкл наружного солевого раствора в квадратную камеру с жирозащитными барьерами.
4. Перенесите рассеченные мозги личинок в камеру на предметном стекле с помощью щипцов. Отрегулируйте положение мозга под эндоскопом для вскрытия, чтобы спинная сторона была обращена вверх.
5. Накройте камеру стеклянной крышкой (22 x 22 x 0,15 мм³). Теперь мозг личинки установлен на предметном стекле в камере, заполненной наружным физиологическим раствором (рис. 1B).
   заметка: Легкое нажатие на покровное стекло ограничивает мозг и уменьшает дрейф образца во время последующего сеанса визуализации.

Рисунок 1: Рабочий процесс протокола визуализации и количественной оценки динамики дендритов. (A) Протокол содержит шесть этапов, охватывающих подготовку образцов, сбор изображений, обработку изображений и полуавтоматическую количественную оценку динамики дендритов. (B) Принципиальная схема, иллюстрирующая камеру визуализации, содержащую эксплант мозга личинки, установленный тыльной стороной вверх. Мозговой эксплант имеет индивидуально помеченный вентральный латеральный нейрон (LNv) в каждой доле и погружается в внешний солевой раствор. Барьеры из вакуумной смазки выдерживают вес покровного стекла и образуют небольшую камеру, которая препятствует движению мозга.