Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в нейральные клетки-предшественники

Аннотация

Источник: Phillips, A. W., et al. Разработка полученных из HiPSC бессывороточных эмбриоидных тел для исследования 3-D культур стволовых клеток с использованием физиологически значимых анализов. J. Vis. Exp. (2017).

Видео демонстрирует технику дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs) в нейральные клетки-предшественники (NPC). Первоначально ИПСК культивируют на питающем слое эмбриональных фибробластов (МЭФ) мыши. Затем клетки отделяют и переносят на пластину с биополимерным покрытием, чтобы позволить MEF прилипать и отделяться от гиПСК. Затем взвешенные ИПСК переносятся на пластину с V-образным дном и центрифугируются с образованием агрегатов. Наконец, добавление среды для дифференцировки индуцирует дифференцировку ИПСК внутри агрегата в НПК.

Протокол

1. Генерация нейронных клеток-предшественников

1. Поддерживайте ИПСК, полученные из фибробластов и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), в 6-луночных планшетах на слое γ облученного эмбрионального фидера мыши (MEF) в среде iPSC человека с добавлением малых молекул.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневное техническое обслуживание является модифицированной версией ранее описанных процедур.
   1. Планшет 6 x 10⁵ MEF на каждую лунку 6-луночного планшета для культуры тканей в рекомендуемой среде 300 μл/лунка (в соответствии с протоколом производителя).
   2. Через 48 ч замените среду MEF на среду 300 мкл/лунку hiPSC на 1 ч перед добавлением hiPSCs.
   3. Быстро разморозьте ИПСК на водяной бане при температуре 37 °C и медленно добавьте 1 мл ИПСК по каплям. Перенесите ИПСК и среду в коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте среду, чтобы довести общий объем до 5 мл. Центрифугировать в течение 4 мин при 129 x g, аспирировать надосадочную жидкость, мягко ресуспендировать гранулу в 1 мл среды hiPSC с ингибитором Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) в концентрации 1:1000.
   4. Поместите клеточную суспензию (обычно засеянную при 300 000 клеток/лунку) на клеточный слой MEF и инкубируйте при 37 °C, 5%_CO2, 95% влажности.
   5. Внимательно контролируйте посев iPSC с помощью светового микроскопа. Через 48 ч удалите культуры, которые имеют неровные края, стали кистозными или выглядят желтовато-коричневыми под световым микроскопом, чтобы свести к минимуму спонтанную дифференцировку><. заметка: Через 7 – 10 дней должны сформироваться колонии иПСК Колонии должны быть круглыми, с четко очерченными границами и равномерной плотностью клеток, и лишенными свободно упакованных неоднородных клеток.
   6. Вручную отбирайте круглые колонии hiPSC, чтобы очистить культуру от спонтанно дифференцированных клеток. Расширьте колонии, поместив их на свежие слои MEF. Расширяйте в соотношении 1:3 каждые 7 дней, когда культуры приближаются к слиянию и замерзают.
2. После экспансии и замораживания клеток (для резервирования) выращивайте колонии гиПСК на пластинах до тех пор, пока они не достигнут 50 - 75% слияния.
3. Через семь дней после осаждения используйте мягкую ферментативную обработку (5-10 мин 300 мкл раствора фермента) и щадящую растирание (2-4 раза 1000 мкл пипета) для сбора и подготовки ИПСК для дифференцировки клеток-предшественников нервов.
4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 129 x g в течение 4 мин, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в среде iPSC человека объемом 5 мл. Перенесите клеточную суспензию в 5-сантиметровую чашку для культивирования клеток размером 5 см, покрытую желатином, на 1 ч при 37 °C для удаления MEF и максимального выхода HiPSC. Переложите среду (с неадгезивными ячейками) в другую посуду, покрытую желатином толщиной 5 см.
5. Перенесите неадгезивные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью передаточной пипетки. Аккуратно промойте пластины средой объемом 3 мл и добавьте ее в пробирку объемом 15 мл.
6. Центрифугируйте клеточную суспензию при 129 х г в течение 4 мин, аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулу в среде. Определите количество ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек. Пластина 9 000 ячеек/лунка в 96-луночной пластине с V-образным дном с низкой адгезией.
7. Центрифугируйте планшет при 163 x g в течение 3 мин. Инкубируйте планшет при 37 °C, влажности 95% и 5% CO₂. С помощью пипетки меняйте 50%-ную среду через день, удаляя половину среды и заменяя ее свежей химически определенной дифференцирующей средой 1 (DM1; Рисунок 1; Таблица материалов) на 14 дней.

Результаты

Рисунок 1: Схема, описывающая первые шаги по подготовке SFEB. После того, как иПСК были собраны с помощью ферментативной диссоциации, их помещают в 96-луночные планшеты и центрифугируют при 163 x g в течение 3 мин для индуцирования быстрой агрегации. Через 14 дней in vitro (DIV) клеточные агрегаты могут быть перенесены с 96-луночных планшетов через широкозахватные пипеты на вкладыши для клеточных кул...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SFEB Среда для культур клеток для дифференцировки нейронов. Реагентов. Компоненты
Среда нейронной индукции STEMdiff (среда hiPSC)	Технологии стволовых клеток	0-5835	250мл
Среда PluriQ ES-DMEM (MEF Media)	ГлобалСтем	GSM-2001
Компоненты мультимедиа DM1
D-MEM/F-12 (1X), Глутамакс жидкий, 1:1	Инвитроген	10565018	385мл
Замена нокаутирующей сыворотки	Инвитроген	10828028	20% 100мл
Ручка/стрептококк	Инвитроген	15140122	5мл
Глутамакс 200 мМ	Инвитроген	35050061	5мл
MEM раствор заменимых аминокислот 10 мМ (100X), жидкий	Инвитроген	11140050	5мл
2-Меркаптоэтанол (1,000X), жидкий	Инвитроген	21985023	900мкл
Малые молекулы
Y27632 (ROCKi)	Стемгент	Режим 04-0012-10	10 мкМ
Компоненты/Материалы
Эмбриональные фибробласты мышей	ГлобалСтем	GSC-6301G
96-луночное V-образное дно с крышками	вечнозелёный	222-8031-01В
Реагент для диссоциации клеток аккутазы StemPro	ТермоФишер	A1110501
6 хорошо плоское дно	сокол	353046