Разработка и поддержание бессывороточных эмбриоидных тел

Аннотация

Источник: Phillips, A. W., et al. Разработка свободных эмбриоидных тел, полученных из HiPSC, для исследования 3-D культур стволовых клеток с использованием физиологически значимых анализов. J. Vis. Exp. (2017).

В видео описывается процедура разработки бессывороточных эмбриоидных тел (SFEBs) из клеток-предшественников нейронов с использованием различных бессывороточных дифференцировочных сред или DM. DM-2 способствует созреванию нейронов и их расположению для формирования SFEB, в то время как DM-3 используется для дальнейшего поддержания роста.

Протокол

1. Индукция бессывороточного эмбриоидного тела (SFEB) (Рисунок 1)

1. Поместите вкладыши для клеточных культур размером 40 мкм в 6-луночные планшеты и добавьте 1 мл дифференцировочной среды 1 (DM1) (Таблица материалов) не менее чем за 1 ч до добавления агрегатов.
2. Перенесите агрегаты нейронных клеток-предшественников со средой объемом 20 мкл с помощью кончика с широким горлышком объемом 200 мкл на вставки для клеточных культур размером 40 мкм и замените среду на DM2 (Таблица материалов).
   заметка: Вставки для клеточных культур представляют собой специализированные вставки, которые находятся немного в стороне от дна лунки и состоят из политетрафторэтиленовой мембраны, подвешенной на пластиковой раме. Эта мембрана биосовместима и может эффективно поддерживать транспортировку питательных веществ и кислорода к SFEB, расположенным сверху. Они обычно используются с органотипическими культурами срезов гиппокампа, взятыми у мыши или крысы.
   1. Перенесите 4-6 агрегатов в одну вставку для клеточной культуры и оставьте достаточное пространство между агрегатами. Удалите как можно больше лишнего раствора с помощью тонкого наконечника для дозатора (например, наконечника объемом 200 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимо кратковременно потревожить SFEB, так как они будут перемещаться по вкладышу клеточной культуры по мере удаления раствора вокруг SFEB.
   2. Поддерживайте культуры в 1 мл DM2 при температуре 37 °C, влажности 95% и 5% CO2. С помощью пипетки меняйте 75% среды через день, удаляя три четверти среды и заменяя ее на три четверти свежей среды. Например, удалите 750 мкл среды и добавьте 750 мкл свежей среды.
3. После 14 дней культивирования переключитесь на среду DM3 (Table of Materials) с изменением среды на 75% через день и еще на 16 дней.
4. Чтобы сохранить SFEBs на вкладышах для клеточных культур более 30 дней, меняйте среду через день в течение 60, 90 и 120 дней><. заметка: SFEB вырастают примерно до 1000 мкм в диаметре и обычно имеют толщину 100-150 мкм.
5. Отсоедините SFEB от вкладыша, аккуратно пипетируя среду с помощью наконечника для дозатора объемом 200 мкл с широким горлышком. Для переноса SFEB с помощью наконечника пипетки с широким горлышком аккуратно всасывайте тела в наконечник пипетки. После загрузки SFEB в наконечник пипетки аккуратно переложите на 12-луночные планшеты и промойте 300 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) на лунку.

Результаты

Рисунок 1: Временная шкала изменений и фаз среды во время роста и расширения SFEB.

После того, как SFEB были перенесены во вкладыши, они претерпевают две смены среды на 14 и 28 дней in vitro (DIV). Обычно их собирают для экспериментов на DIV 30, 60 и 90. Верхние вставки показывают различные фазы этого процесса. Масштабные линейки = 1 000 μм (крайний сл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SFEB Среда для культур клеток для дифференцировки нейронов. Реагентов. Компоненты
Среда нейронной индукции STEMdiff (среда hiPSC)	Технологии стволовых клеток	0-5835	250мл
Среда PluriQ ES-DMEM (MEF Media)	ГлобалСтем	GSM-2001
Компоненты мультимедиа DM1
D-MEM/F-12 (1X), Глутамакс жидкий, 1:1	Инвитроген	10565018	385мл
Замена нокаутирующей сыворотки	Инвитроген	10828028	20% 100мл
Ручка/стрептококк	Инвитроген	15140122	5мл
Глутамакс 200 мМ	Инвитроген	35050061	5мл
MEM раствор заменимых аминокислот 10 мМ (100X), жидкий	Инвитроген	11140050	5мл
2-Меркаптоэтанол (1,000X), жидкий	Инвитроген	21985023	900мкл
Компоненты мультимедиа DM2
D-MEM/F-12 (1X), Глутамакс жидкий, 1:1	Инвитроген	10565018	500мл
Глутамакс 200 мМ	Инвитроген	35050061	5мл
Ручка/стрептококк	Инвитроген	15140122	5мл
N-2 Добавка (100X), жидкая	Инвитроген	17502048	10мл
Компоненты мультимедиа DM3
НЕЙРОБАЗАЛЬНАЯ Среда (1X), жидкая	Инвитроген	21103049	500мл
Добавка B-27 минус витамин А (50X), жидкость	Инвитроген	12587010	10мл
Глутамакс 200 мМ	Инвитроген	35050061	5мл
Ручка/стрептококк	Инвитроген	15140122	5мл
Компоненты/Материалы
	Миллиячейка	PICM0RG50
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	ТермоФишер	10010023	500 мл