Построение структурированных нейронных цепей на многоэлектродной матрице

Аннотация

Источник: Каннер, С., и др. Проектирование, обработка поверхности, ячеистое покрытие и культивирование модульных нейронных сетей, состоящих из функционально взаимосвязанных цепей. J. vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует процесс культивирования нейронных клеток на массиве с несколькими электродами (MEA) для создания модульных нейронных сетей. Этот метод позволяет изучать передачу нейронных сигналов и клеточные взаимодействия.

Протокол

1. Подготовка многоэлектродной матрицы (MEA)

1. Очистите MEA в таком порядке (Таблица материалов):
   1. Промыть водой под краном и обработать ультразвуком в концентрированном, ферментативном моющем средстве 3 раза.
   2. Обработать ультразвуком в дистиллированной воде 3 раза.
   3. Вымыть дистиллированной водой (в колпаке, кончик 1 000 мкл) 3 раза и поместить под ультрафиолет (УФ) на 30 минут.
2. Вспомогательная подготовка сети:
   1. Подготовьте спроектированную опорную сетевую форму.
      1. Налейте полидиметилсилоксан (PDMS) в 12-луночный планшет (диаметр 22 мм).
      2. Когда PDMS затвердеет, снимите форму и с помощью скальпеля вырежьте отверстие посередине, чтобы создать форму кольца.
      3. Поместите спроектированную опорную сетчатую форму в центр MEA (Рисунок 1A) и покройте остальную поверхность поли-D-лизином (PDL) на 2 часа при комнатной температуре (RT).
   2. Удалите PDL с помощью пипетки и промойте дистиллированной водой.
   3. Снимите плесень и дайте высохнуть (рисунок 1А).
3. Выровняйте трафарет по MEA следующим образом:
   1. Поместите трафарет на обозначенный микроманипулятор. С помощью перевернутого микроскопа точно выровняйте структурированную структуру по электродам и опустите трафарет до тех пор, пока он не будет помещен на поверхность MEA (рис. 1B).
      заметка: Контакт с хорошо очищенным MEA обеспечивает конкурентную адгезию между PDMS и самим MEA.
   2. Поднимите микроманипулятор и, при необходимости, с помощью пинцета надавите на небольшую величину давления над PDMS, чтобы предотвратить его отсоединение от MEA.
   3. Аккуратно прижмите трафарет к поверхности MEA и с помощью микроскопа убедитесь, что он надежно прикреплен и хорошо выровнен (рисунок 1C-D).
4. Поместите MEA в вакуумную камеру на 15 минут, нанесите 1 мл капли PDL на трафарет.
5. Вставьте в вакуумную камеру 2 раза по 20 мин каждый. Оставьте PDL для высыхания O/N в инкубаторе.
6. Перед нанесением покрытия снимите трафареты PDMS с MEA и промойте их стерильной водой. Поместите под ультрафиолетовое излучение на 7 минут.

2. Покрытие

1. Рассчитать количество клеток, необходимых для гальванического покрытия, можно с помощью гемоцитометра
   1. Убедитесь, что счетная камера (гемоцитометр) чистая, и наденьте на нее защитную крышку (для очистки используйте спирт).
   2. Разведите 10 мкл клеточной суспензии в 190 мкл гальванической среды (разведение 1:20).
   3. Загрузите 10 μл разбавленных клеток на край счетной камеры и медленно выведите клетки пипеткой, позволяя камере заполниться самостоятельно.
   4. С помощью инвертированного микроскопа визуализируйте сетку гемоцитометра. Определяют количество клеток в камере путем прямого подсчета (здоровые клетки должны быть круглыми). Подсчитайте ячейки в большом квадрате так, чтобы они не пересекали края.
   5. Рассчитать концентрацию клеток:
      Общее количество клеток/1000 мкл = Общее количество клеток, подсчитанных × фактором разведения × 10⁴ (площадь гемоцитометра).
      заметка: Например, если коэффициент разбавления равен 20, а общее количество подсчитанных клеток равно 100:
      100 × 20 × 10⁴ = 0,1 x 10⁷ ячеек/1 000 мкл или 1 x 10⁶/100 мкл. Для того чтобы наложить 0,75 x 10^{на 6} клеток, выньте из ячеек 75 μл.
2. Возьмите количество клеток, необходимое для нанесения покрытия на одну МЭА или чашку Петри, повторно суспендируйте ячейки, чтобы предотвратить агрегацию, и поместите их в центр, поверх структурированной области (при необходимости клетки можно разбавить в среде). Для MEA поместите каплю объемом 100 мкл в середину. Для покровного стекла поместите каплю объемом 1 000 мкл в середину.
3. Инкубируйте гальванизированные клетки при 37 °C в течение 40 мин. Добавьте к гальваническим клеткам гальваническую среду до 1 мл на MEA и 2 мл на покровную крышку.
4. Хранить при температуре 37 °C и разбавлять свежей средой для выращивания, обогащенной 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 и 0,75% глутамаксом каждые 4 дня.
5. С 6/7 DIV, после обнаружения связей между островками, разведите среду до 10 мкл/мл FUDR (25 мг дезоксиуридина + 62,5 мг уридина в 12,5 мл MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) или любого другого антимитотического средства для предотвращения глиального разрастания.

Результаты

Рисунок 1. Осаждение структур PDMS на MEA. (A) Форма PDMS с формой кольца (отмечена красной стрелкой), установленная на MEA. Форма используется для покрытия области, предназначенной для поддерживающей нейронной сети и расположенной на периферии зоны культивирования (это ограничено кольцом, установленным на MEA и отмеченным зеленой стрелкой). (B) Выравнивание трафарета PDMS по MEA ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PDMS, Сильгард 184	Индекс Dow Corning
Вакуумная камера Nalgene	термо	5305-0609 (Английский)
Поли-D-лизин PDL	сигма	П7886
12-луночный планшет для культивирования	сигма	CLS3336
5-фтор-2'-дезоксиуридин	сигма	Ф0503
MEA1060-INV-BC	Многоканальные системы
ТК02	Многоканальные системы
Стрептококк	Биологическая промышленность Бейт Хаемек	03-033-1с
В-27	Gibco	17504044
glutaMAX	Gibco	35050-038 (Английский)
MEM Minimum Essential Medium-Eagle	Биологическая промышленность Бейт Хаемек	01-025-1Б
Микроэлектродные матрицы 4Q	Многоканальные системы	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	Инструкция по очистке: http://www.multichannelsystems.com