Дифференцировка сконструированных плюрипотентных стволовых клеток человека в функциональные мотонейроны

Аннотация

Источник: Garone, M. G., et al. Преобразование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs) в функциональные спинальные и черепные мотонейроны с использованием векторов PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует процесс дифференциации человеческих iPSC в моторные нейроны. Обоснование заключается в использовании иПСК, которые были генетически модифицированы для экспрессии специфических транскрипционных факторов. При культивировании в среде, содержащей доксициклин, этот антибиотик запускает экспрессию транскрипционных факторов, тем самым способствуя дифференцировке iPSC в предшественники моторных нейронов. В конечном счете, предшественники культивируются в нейронной среде для получения зрелых и функциональных моторных нейронов.

Протокол

1. Поддержание ИПСК человека

1. Подготовка пластин с матричным покрытием
   1. Разморозьте один флакон матрицы объемом 5 мл (см. Таблицу материалов) при 4 °C в течение ночи. Исходные матричные запасы имеют разную концентрацию запасов, а аликвоты изготавливаются в соответствии с коэффициентом разбавления, указанным в техническом описании, и специфичными для каждой отдельной партии. Крайне важно держать флакон и пробирки ледяными, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование матрицы. Дозируйте матрицу в аликвоты в предварительно охлажденных криопробирках на льду. Заморозьте неиспользованные аликвоты при температуре -20 °C.
   2. Положите одну аликвоту на лед примерно на 2 часа, чтобы она оттаяла.
   3. Разбавьте аликвоту матрицы 20 мл холодного DMEM/F12 в конической пробирке объемом 50 мл.
   4. Хорошо перемешайте и разложите 1 мл разбавленной матрицы по чашкам диаметром 35 мм (эквивалентное количество на площадь поверхности других посуд).
   5. Посуду с разбавленной матрицей хранить в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы обеспечить покрытие.
      заметка: Посуда, запечатанная парапленкой, может храниться при температуре 4 °C до 2 недель.
2. Приготовление исходного раствора (20 мл) и 1х рабочих аликвот реагента для щадящей диссоциации клеток (см. Таблицу материалов).
   1. Растворите порошок до 10 мг/мл в PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free)
   2. Фильтр стерилизуется через фильтрующую мембрану толщиной 0,22 мкм.
   3. Приготовьте 20 аликвот (по 1 мл каждая) и храните их при температуре -20 °C.
   4. Перед применением разведите одну аликвоту в PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free) до 1 мг/мл (1x рабочая аликвота).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x рабочие аликвоты можно хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель.
3. Пассирование ИПСК человека.
   1. Перед началом: При хранении при температуре 4 °C предварительно нагрейте пластины с матричным покрытием в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 20-30 мин. Предварительно нагрейте при комнатной температуре необходимое количество среды iPSC для человека (см. Таблицу материалов). Предварительно прогрейте DMEM/F12.
   2. Аспиратная питательная среда.
   3. Промойте иПСК с PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free).
   4. Добавьте 1x щадящий раствор для диссоциации (0,5 мл для чашки 35 мм). Инкубировать при 37 °C до тех пор, пока края колоний не начнут отделяться от пластины, обычно 3-5 минут.
   5. Отсасывайте щадящий раствор диссоциации, стараясь не отсоединить колонии иПСК.
   6. Промойте клетки с помощью DMEM/F12 (2 мл для чашки 35 мм) и аспирируйте, стараясь не отсоединить клетки. Повторите этот шаг еще раз.
   7. Добавьте человеческую среду iPSC (1 мл для чашки 35 мм).
   8. Аккуратно отделите колонии с помощью клеточного лифтера и перенесите их в трубку объемом 15 мл.
   9. Аккуратно разбейте комки клеток, пипетируя пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 3-4 раза.
   10. Отсасывайте надосадочную жидкость из пластины (пластин, покрытых матричным покрытием).
   11. Засейте клетки в соответствующий культуральный объем среды iPSC человека. Коэффициент разделения может варьироваться от строки к строке и составляет примерно 1:4-1:8. Меняйте среду ежедневно.

2. Генерация индуцируемых линий iPSC NIL и NIP

1. Клеточная трансфекция
   1. Промойте клетки PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free).
   2. Добавьте реагент для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) (0,35 мл для чашки диаметром 35 мм) и инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока отдельные клетки не будут разделены (5-10 мин).
   3. Аккуратно завершите разделение клеток, пипетируя пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 3-4 раза.
   4. Соберите в пробирку объемом 15 мл и добавьте PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free) в 10 мл. Посчитайте клетки.
   5. Пеллеты 10⁶ элементов и ресуспендировать в 100 мкл буфера R (входит в комплект электропорации ячеек; см. Таблицу материалов).
   6. Добавьте плазмидную ДНК для трансфекции: 4,5 мкг транспонируемого вектора (epB-Bsd-TT-NIL или epB-Bsd-TT-NIP12) и 0,5 мкг плазмиды транспозазы piggyBac.
   7. Трансфектируйте с помощью системы электропорации ячеек (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя и как описано ранее со следующими параметрами: напряжение 1 200 В, ширина 30 мс, 1 импульс. Засейте клетки в среду iPSC человека с добавлением 10 μM Y-27632 (ингибитор ROCK, см. Таблицу материалов) в чашке с матричным покрытием толщиной 6 мм.
2. Подбор с антибиотиками
   1. Через два дня после трансфекции добавьте 5 мкг/мл бластицидина в питательную среду.
   2. Большинство нетрансфицированных клеток погибают в течение 48 ч после выбора бластицидина. Держите клетки в бластицидине не менее 7-10 дней для контротбора клеток, которые не интегрировали трансгены в геном.
   3. Поддерживайте стабильно трансфицированные клетки в виде смешанной популяции, состоящей из клеток с разным числом трансгенов и разными сайтами интеграции, или изолируйте отдельные клоны.
   4. Приготовьте дополнительную чашку для проверки эффективной экспрессии трансгенов при индукции доксициклина в концентрации 1 мкг/мл методом ОТ-ПЦР с трансген-специфичными праймерами для Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Реверс: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT).
   5. На этом этапе замораживают запасы новых линий NIL- и NIP-iPSC в замораживающей среде для iPSC человека (см. Таблицу материалов).

3. Дифференцировка моторных нейронов

1. Диссоциируйте клетки с помощью реагента для диссоциации клеток, как описано (шаги 2.1.1.-2.1.3.). Соберите диссоциированные клетки в пробирку объемом 15 мл и разбавьте 5 объемами DMEM/F12. Гранулируют клетки и ресуспендируют в среду iPSC человека с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK. Подсчитайте клетки и семена на чашках с матричным покрытием при плотности 62 500 клеток/^см2.
2. На следующий день замените среду на DMEM/F12, дополненную 1x стабильным аналогом L-глютамина, 1x добавкой для клеточных культур с заменимыми аминокислотами (NEAA) и 0,5x пенициллином/стрептомицином, содержащим 1 мкг/мл доксициклина. Это считается днем 0 дифференциации. В 1 день освежите среду и доксициклином.
3. На 2-й день смените среду на нейробазальную/B27 (нейробазальную среду с добавлением 1x B27, 1x стабильный аналог L-глютамина, 1x NEAA и 0,5x пенициллин/стрептомицин), содержащую 5 мкМ DAPT, 4 мкМ SU5402 и 1 мкг/мл доксициклина (см. Таблицу материалов). Обновляйте среду и доксициклин каждый день до 5 дня.
4. День 5: Диссоциация клеток реагентом для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов).
   1. Промойте клетки PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free).
   2. Добавьте реагент для диссоциации клеток (0,35 мл для чашки диаметром 35 мм) и инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока весь монослой клеток не отделится от чашки><. Обратите внимание, что отдельные клетки не будут отделяться во время инкубации.
   3. Добавьте 1 мл DMEM/F12 и соберите клетки в пробирку объемом 15 мл.
   4. Аккуратно завершите разделение клеток, пипетируя пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 10-15 раз.
   5. Добавьте 4 мл DMEM/F12 и посчитайте клетки.
   6. На этом этапе прогениторы моторных нейронов замораживают в среде для замораживания клеток (см. Таблицу материалов), в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Гранулируйте клетки и ресуспендируйте в нейрональной среде (нейробазальная/B27-среда с добавлением 20 нг/мл BDNF, 10 нг/мл GDNF и 200 нг/мл L-аскорбиновой кислоты, см. Таблицу материалов) с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK.
   8. Засейте клетки на полиорнитин/ламинин или альтернативно на подложки с матричным покрытием с плотностью 100 000 клеток/^см2. Для иммуноокрашивания используйте пластиковые опоры μ-Slide с полимерным покровным стеклом (см. Таблицу материалов).
5. На 6-й день смените среду на свежую среду Neuronal Medium, лишенную ингибитора ROCK. В последующие дни обновляйте половину средства каждые 3 дня. Питательную среду необходимо менять очень осторожно, чтобы не допустить отслоения от поверхности.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аккутаза	Сигма-Олдрич	А6964-100МЛ	Реагент для диссоциации клеток
В27	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-093-566	Бессывороточная добавка для поддержания нейрональных клеток
Бамбанкер	Ниппон Дженетикс	НГЭ-ВВ02	Среда для замораживания клеток, используемая здесь для предшественников моторных нейронов
БДНФ	ПрепроТех	450-02	Нейротрофический фактор мозга
Бластицидин	Сигма-Олдрич	No 203350	Нуклеозидный антибиотик, ингибирующий синтез белка у прокариот и эукариот
БСА	Сигма-Олдрич	А2153	Бычья сыворотка альбумина. Блокатор для предотвращения неспецифического связывания антител в иммуноокрашивающих анализах
CaCl2	Сигма-Олдрич	С3881	Химикаты для электрофизиологических растворов
Матрица, сертифицированная Corning Matrigel hESC	Корнинг	354277	Химикаты для электрофизиологических растворов
ФИЛЬТРУЮЩИЙ МАТЕРИАЛ CRYOSTEM ACF	Биологическая промышленность	05-710-1Е	Замораживающая среда для ИПСК человека
D-глюкоза	Сигма-Олдрич	Г5146	Химикаты для электрофизиологических растворов
ДАПТ	АдипоГен	АГ-КР1-0016-М005	Ингибитор гамма-секретазы
Диспайз	Gibco	17105-041	Реагент для щадящей диссоциации иПСК человека
DMEM/F12	Сигма-Олдрич	Д6421-500МЛ	Базальная среда для культивирования клеток
Доксициклин	Сигма-Олдрич	Д9891-1Г	Используется для индукции экспрессии трансгенов из векторов epB-Bsd-TT-NIL и epB-Bsd-TT-NIP
ДС2У	WiCell	UWWC1-DS2U	Коммерческая линия iPSC для человека
ГДНФ	ПрепроТех	450-10	Глиальный нейротрофический фактор
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	А18945	Коммерческая линия iPSC для человека
Глутамакс	Thermo Fisher Scientific	35050038	Альтернатива L-глютамину с повышенной стабильностью. Улучшает здоровье клеток.
Хепес	Сигма-Олдрич	Н4034	Химикаты для электрофизиологических растворов
L-аскорбиновая кислота	Лаборатории ЛКТ	А7210	Используется в клеточных культурах в качестве антиоксиданта
Ламинин	Сигма-Олдрич	11243217001	Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	заменимые аминокислоты. Используется в качестве добавки к клеточной культуральной среде, для увеличения роста и жизнеспособности клеток.
Набор Neon 100 μL	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Комплект для электропорации ячеек
Неоновая трансфекционная система	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Система электропорации ячеек
Нейробазальная среда	Thermo Fisher Scientific	21103049	Базальная среда предназначена для долгосрочного поддержания и созревания популяций нейрональных клеток без необходимости использования питающего слоя астроцитов
NutriStem-XF/FF	Биологическая промышленность	05-100-1А	Питательная среда для ИПСК человека
ПБС	Сигма-Олдрич	Д8662-500МЛ	Фосфатный буферный раствор Дульбекко, с кальцием, с магнием
PBS Ca2+/Mg2+ без	Сигма-Олдрич	Д8537-500МЛ	Фосфатный буферный раствор Дульбекко, без кальция, без магния
Пенициллин/стрептомицин	Сигма-Олдрич	П4333-100МЛ	Раствор пенициллина/стрептомицина, используемый для предотвращения контаминации клеточных культур бактериями.
полиорнитин	Сигма-Олдрич	П4957	Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
СУ5402	Сигма-Олдрич	SML0443-5МГ	Селективный ингибитор рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR-2)
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Т8787	4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль, т-октилфеноксиэтоксиэтанол, полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир. Используется для пемеабилизации клеток в иммуноокрашивающих анализах
Y-27632 (ингибитор ROCK)	Энцо Медико-Биологические Науки	АЛКС-270-333-М005	Проникающий в клетки селективный ингибитор Rho-ассоциированной, спиральной спирали, содержащей протеинкиназу (ROCK). Повышает выживаемость iPSC
μ-горка на 8 лунок	Там же	80826	Поддержка высококачественного микроскопического анализа фиксированных клеток