Создание 3D-модели совместного культивирования фибробластов и нейронов роговицы человека

Аннотация

Источник: Sharif, R., et al. Инженерия тканей роговицы: in vitro модель взаимодействия стромального нерва роговицы человека. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует технику создания трехмерной системы модели совместной культуры первичных фибробластов роговицы человека и дифференцированных нейрональных клеток. Эта система совместного культивирования может быть использована для изучения взаимодействий стромального нерва.

Протокол

1. Первичные HCF (фибробласты роговицы человека) Культивирование и сборка 3D-конструкций

1. Собрать 3D-конструкции из эксплантов, ранее выращенных в EMEM 10% FBS 1% антибиотика/антимикотика, пассировать и подсчитать HCFs.
2. Засейте примерно 1 x 10⁶ клеток/лунку первичных HCF на поликарбонатные мембранные вставки с порами 0,4-мкм из 3D-конструкций вместе с 1,5 мл свежих EMEM 10% FBS 1% антибиотика/антимикотика до верха конструкции. Добавьте еще 1,5 мл того же носителя на дно каждой конструкции.
3. Через 24 ч после посева клеток культивируют клетки с помощью EMEM 10% FBS 1% антибиотика/антимикотика, стимулированного 0,5 мМ 2-O-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой (витамин С) путем добавления 1,5 мл сверху и 1,5 мл снизу каждой конструкции.
4. Поддерживайте культуры в инкубаторе при температуре 37 °C, 5 %_CO2 в течение 3 недель и подавайте свежие среды через день в течение всего периода исследования. Никакого дальнейшего прохода не требуется.

2. Клеточная дифференцировка и кокультуры

1. Через 3 недели добавьте 8 x 10³ клеток/лунку клеток нейробластомы человека SH-SY5Y поверх ранее собранных 3D-конструкций, содержащих 1,5 мл EMEM, содержащей 10% FBS, 1% антибиотика/антимикотика и 0,5 мМ 2-O-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты (витамин С).
   1. Дайте клеткам нейробластомы SH-SY5Y расти на вершине стромальных клеток роговицы в течение не менее 24 ч, прежде чем начать дифференцировку клеток.
2. Инициируйте дифференцировку клеток SH-SY5Y, стимулируя клетки EMEM, содержащим 1% FBS и 1,5 мл 10 мкМ ретиноевой кислоты поверх конструкции. Добавьте 1,5 мл EMEM 10% FBS 1% антибиотика/антимикотика 0,5 мМ 2-O-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты (витамин С) на дно конструкции. Обратите внимание, что этап приема ретиноевой кислоты следует выполнять в темное время суток.
   1. Продолжайте культивировать клетки в этой среде для дифференцировки в течение 5 дней.
3. Когда клетки достигнут фазы дифференцировки, переключите клетки на 1,5 мл бессывороточной среды, содержащей 2 нМ нейротрофического фактора мозга (BDNF) и 1% антибиотика/антимикотика, добавленного в EMEM, путем добавления в верхнюю часть конструкции. Добавьте 1,5 мл EMEM 10% FBS 1% антибиотика/антимикотика 0,5 мМ 2-O-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты (витамин С) на дно конструкции. Обратите внимание, что шаг BDNF следует выполнять в темное время суток.
4. Культивируйте клетки в течение 2 дополнительных дней перед обработкой для дальнейшего анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатный буферный раствор Дульбекко (1X)	Gibco от Life Technologies	14190-144
Стерильные щипцы	Научный Фишер	Тел.: 13-812-42	Fisherbrand рассекающие щипцы для осколков с очень тонким заострением
Лезвия бритвы с одним лезвием	Персонна	No 270100
Стерильные хирургические лезвия скальпелей No10	Хирургическое лезвие из перьев	2976#10
Минимальная необходимая среда Eagle's	АТКС	30-2003
Фетальная бычья сыворотка	Атланта Биолакс	С11550	Для подготовки носителя требуется 10% FBS
Антибиотик-антимикотик (100X)	Gibco от Life Technologies	15240-062	Для приготовления сред требуется 1% антибиотик-антимикотик
0,05% трипсина ЭДТА (1X)	Gibco от Life Technologies	25300062
Мембранные вставки из поликарбоната с порами 0,4 мкм	Корнинг Костар	No 3412
2-O-α-дглукопиранозил-L-аскорбиновая кислота (витамин С)	Сигма-Олдрич	SMB00390-14	Для исследования следует использовать концентрацию 0,5 мМ
SH-SY5Y Клетки нейробластомы	АТКС	SHSY5YATCC CRL-2266
Ретиноевая кислота	Сигма-Олдрич	SRP3014-10UG	Необходимо использовать конечную концентрацию 10 мкМ
БДНФ	Сигма-Олдрич	Р2625-100МГ	Необходимо использовать конечную концентрацию 2 нМ
Диметилсульфоксид (ДМСО)	VWR-Альфа Аэсар	Тел.: 67-68-5	Сверхчистый стерильный ДМСО для использования
Обработанные клеточными культурами Nunc компании Thermo Scientific EasYFlasks (T25)	Научный центр Фишера	Тел.: 12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture, обработанные EasYFlasks (T75)	Научный центр Фишера	Тел.: 12-565-349

гг. гг.