Иммуноокрашивание тканей для визуализационной масс-цитометрии

Аннотация

В видео описывается подготовка образца ткани для визуализации массовой цитометрии. Сначала ткань обрабатывается для демаскирования эпитопов антигенов, проникновения в клетки и блокирования неспецифических сайтов связывания антител. Затем ткань инкубируют с коктейлем антител, конъюгированным с металлом, и ядерным красителем. Наконец, обработанный образец ткани визуализируется с помощью оптического сканера.

Протокол

1. Предварительная обработка тканей:

Для свежезамороженных тканей:

1. Поместите стеклянную банку Coplin в морозильную камеру при температуре -20°C не менее чем на час перед использованием.
2. Достаньте предметные стекла из морозильной камеры при температуре -80°C и поместите их в стеклянную банку Coplin в морозильную камеру при температуре -20°C не менее чем на 15 минут.
3. Под вытяжным шкафом с помощью ампулореза откройте стеклянную ампулу с 16% параформальдегидом (PFA). Выбросьте разбитое стекло соответствующим образом.
4. Добавьте 10 мл 16% PFA и 30 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в пластиковую банку Coplin. Убедитесь, что PBS предварительно охлажден до 4°C.
5. Перелейте этот раствор в холодильник при температуре 4°C не менее чем на 15 минут.
6. Через 15 минут переложите стеклянную банку Coplin с предметными стеклами в холодильник при температуре 4°C на 10 минут.
7. Переложите предметные стекла из стеклянной банки в пластиковую банку Coplin, содержащую холодный 4% раствор PFA.
8. Зафиксируйте горки с 4% PFA на 30 минут внутри холодильника.
9. Промойте предметные стекла трижды при комнатной температуре PBS в течение 5 минут каждая, обеспечивая тщательное ополаскивание между циклами.

Для тканей FFPE:

1. Начните с 5 мкм фиксированных формалином парафинных срезов (FFPE), установленных на положительно заряженных стандартных предметных стеклах микроскопа.
2. Депарафинизируйте предметные стекла, нагревая их при температуре 60°C в течение часа.
3. Снимите предметные стекла и охладите их до комнатной температуры в течение примерно 5 минут.
4. Поместите слайды в почтовую машину для слайдов и промойте их в ванне с ксилолом в течение 3 минут дважды.
5. Снова промойте горки 100% этанолом в течение 1 минуты, дважды.
6. Аналогичным образом промойте предметные стекла в 95% и 70% этаноле в течение 1 минуты каждая.
7. Наконец, дважды ополосните дистиллированную воду в течение 3 минут.
   заметка: Hyperion не может абляться в пределах 2 мм от края предметного стекла, максимально центрировать ткани.

2. Извлечение эпитопов с помощью тепла (HIER)

1. Приготовьте буфер pH9 для трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА):
   1. Буфер Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER приобретается в 100 раз и разбавляется в 1 раз в воду для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
   2. Пример: 2,5 мл Abcam ab93684 в 247,5 мл воды ВЭЖХ.
      заметка: Буфер старше шести месяцев использовать не следует.
2. Установите камеру демаскировки для нагрева горки. Сначала заполните дно камеры 500 мл водопроводной воды. Затем добавьте 250 мл водопроводной воды в обе боковые емкости и 200 мл водопроводной воды в центральную емкость.
3. Поместите до 3 слайдов в 5-местную почтовую программу.
4. Наполните доску слайдов буфером HIER до тех пор, пока ткань полностью не погрузится в воду. заметка: Убедитесь, что у скользящего почтового устройства есть небольшое отверстие в верхней части для выпуска пара и предотвращения создания давления.
5. Запустите «Программу 4» в течение 20 минут при температуре 95 °C.
6. Тем временем предварительно прогрейте инкубационные камеры для последующих этапов (см. шаг 3.5)
7. После инкубации извлеките почтовый ящик и поместите его в ванну с холодной водой из крана.
8. Дайте ему остыть в течение 5 минут.
9. Снимите половину буфера с почтового ящика и замените его дистиллированной водой. Дайте ему остыть в течение 5 минут.
10. Постепенно удаляйте буфер и увеличивайте объем воды в два раза, каждый раз с 5-минутным периодом охлаждения.
11. Наконец, промойте предметные стекла в 100% дистиллированной воде.

3. Блокировка неспецифической привязки

1. Приготовьте блокирующий буфер (Трис-буферный физиологический раствор или TBS, 0,1% Triton X-100, 3% бычий сывороточный альбумин или BSA), добавив 150 мкл TBS с 10% BSA к 350 мкл TBS с 0,1% Triton X-10,
   заметка: TBS с 10% BSA хранится при температуре -20 °C и каждый раз должен размораживаться свежим.
2. С помощью слайд-мейлера или баночек Coplin промойте слайды в течение 5 минут в TBS, 0,1% Triton X-100 дважды.
3. Извлеките слайд из почтовой программы и с помощью салфетки Кима удалите все буферы за пределами круга PAP. Дайте ~1 минуте немного подсохнуть.
4. Используя P200, добавьте несколько капель блокирующего буфера на ткань, ровно столько, чтобы покрыть ее. ПАП-капельница должна удерживать жидкость над тканью.
   заметка: Если буфер не ограничен кругом ПАП, повторно нарисуйте круг ПАП вокруг ткани, чтобы предотвратить потерю антител в дальнейшем.
5. Выдержать предметное стекло при комнатной температуре в камере с влажностью в течение 1 часа. <бр/> заметка: Пустая коробка с наконечником для пипетки хорошо подходит для камеры с влажностью. Убедитесь, что на дне присутствует небольшое количество водопроводной воды.

4. Окрашивание металл-конъюгированными антителами

1. Удалите конъюгированные с металлом антитела при температуре 4°C и центрифугируйте при 10 000 x G в течение 1 минуты.
2. Приготовление оптимального разведения мастер-смеси антител в TBS, 0,1% Triton X-100 и 1% смеси BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: а) Оптимальное разведение каждого антитела должно быть определено экспериментально и является одним из наиболее важных этапов для успешных экспериментов по масс-цитометрии с визуализацией. Используйте таблицу Excel для расчета объемов. Производите лишь немного больше, чем требуется из-за стоимости антител. Например, если потребовалось 200 мкл блокирующего буфера, сделайте мастер-микс на 250 мкл. б) Мастер-микс должен быть подготовлен свежим для каждого эксперимента на этапе блокировки.
3. После инкубации (см. пункт 3.5) извлеките предметное стекло из инкубатора.
4. Удалите лишний блокирующий буфер, постукивая предметным колпачком вертикально и горизонтально по салфеткам Кима. Это должно оставить некоторое количество блокирующего буфера на ткани, но удалит большую его часть.
5. Дайте ~1 минуте немного подсохнуть.
6. Поместите предметное стекло в камеру с температурой 4°C и дайте ему уравновеситься.
7. Затем тщательно пипеткой нанесите мастер-смесь антител на ткань, предельно следя за тем, чтобы раствор содержался в пределах круга ПАП.
8. Закройте камеру с влажностью и выдерживайте в течение ночи при температуре 4°C.
9. После ночной инкубации снимите предметное стекло с температуры 4°C и удалите излишки мастер-микса, постукивая по предметному стеклу вертикально и горизонтально по салфеткам Кима.
10. Поместите предметное стекло в почтовый ящик или банку Coplin; промойте в течение 5 минут фосфатно-солевым буфером или PBS, дополненным 0,2% Triton X-100, дважды.
11. Затем промойте предметное стекло в PBS в течение 5 минут, дважды. Снимите предметное стекло и дайте ему высохнуть в течение примерно 1 минуты.

5. Интеркаляция ДНК

1. Для интеркаляции ДНК разбавьте интеркалятор-IR 1:1000 в PBS.
Осторожно нанесите
2. разведенный интеркалятор на ткань, предельно следя за тем, чтобы раствор содержался внутри круга ПАП.
3. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в камере влажности, используемой для блокировки.
4. После этого постучите предметными стеклами вертикально и горизонтально по салфеткам Ким, чтобы удалить излишки красителя Intercalator-Ir.
5. Поместите предметное стекло в почтовый ящик или банку Coplin и дважды промойте водой ВЭЖХ в течение 5 минут каждый.
6. Перед сканированием высушите предметные стекла в эксикаторе в течение 5 минут.

6. Сканирование изображений

1. Для сканирования слайдов используйте гравировщик с твердосплавным наконечником, чтобы выцарапать четыре слабые буквы «X» на предметном стекле. Точные обучающие баллы позволят наилучшей регистрацией изображений.
   заметка: Не подходите слишком близко к краю.
2. Сканирование с помощью планшетного документ-сканера со скоростью не менее 1200 точек на дюйм
3. Обрежьте это изображение как можно ближе к границам слайда и сохраните его на флешку.
4. Для совместной регистрации изображения отсканируйте слайд на нанозумере Hamamatsu с именем файла «Pre_IMC».

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение процедуры иммуноокрашивания тканей для визуализационной масс-цитометрии

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Оборудования
Коплинские банки
Пластиковый почтовый автомат на 5 слайдов с вентиляционным отверстием
Устройство для забора антигена (камера демаскировки)
сканер
Химикаты и ферменты:
ксилол
Этанол 200 пробы
Вода для ВЭЖХ
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER буфер
ТБС
TBS с 0,1% Trition X-100
TBS с 10% BSA
ПБС
PBS с 0,2% Trition X-100