$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка ломтика
- Постройте или получите камеру для извлечения срезов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип работы в камере восстановления прост и может быть изготовлен в лаборатории (Рисунок 1). Вкратце, камера представляет собой вместилище, в которое вставляется корзина для удержания срезов мозга на уровне, который ниже поверхности искусственной спинномозговой жидкости (АКСФ).
- В качестве примера получится четыре кольца (высотой 4 - 6 мм) (рисунок 1А, вид сбоку; Б, вид сверху) разрезанием 30-кубового шприца. Затем приклейте натянутые сетки (например, вырезанные из нейлонового шланга) к одной стороне колец, чтобы удерживать срезы мозга (рисунок 1B), и склейте кольца вместе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать клеевой пистолет.
- После того, как четыре кольца будут приклеены, приклейте изогнутую изобедренную стенку трапециевидной формы к двум кольцам (Рисунок 1A и B), чтобы отвести пузырьки кислорода от восстанавливающихся срезов мозга (Рисунок 1C и D). Как показано на рисунке 1D, вставьте систему диффузии кислорода (в данном случае газодисперсионную трубку) на ту же сторону, что и пластиковые стенки.
- Перед нарезкой нарежьте кислородом (95% O2/5% CO2) и охладите раствор для нарезки (см. шаг 1.4) до 0 - 2 °C.
- Заполните специальную камеру восстановления стандартным аCSF при комнатной температуре (RT). Убедитесь, что аКСФ хорошо насыщен кислородом (20 - 30 минут, время может варьироваться в зависимости от объема камеры) перед помещением ломтиков в камеру восстановления. Следите за тем, чтобы пузырьки газа не вступали в прямой контакт с ломтиками и не разрушали их.
- Выстелите вибратомный лоток для льда льдом и наполните его холодной водой так, чтобы от одной трети до половины камеры для нарезки было погружено. Осторожно поместите систему подачи кислорода (например, газодиффузионный камень) и температурный зонд в камеру для нарезки, чтобы ни один из предметов не мешал движению лезвия или манипуляциям с ломтиками.
- Подготовьте область вскрытия и инструменты, необходимые для извлечения мозга и препарирования нужной области мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точное вскрытие будет зависеть от конкретной области мозга, поскольку различные структуры мозга потребуют срезов в разных плоскостях (например, корональные, сагиттальные или горизонтальные срезы).
- Положите на пеленку следующие инструменты: ножницы для обезглавливания, скальпель, маленькие ножницы с прямым острым концом, щипцы для канюляции сосудов (или любой хирургический инструмент с широким наконечником, например, ронжеры, который больше подходит для черепов крыс), изогнутые кровоостанавливающие щипцы, пинцет, шпатель, лопатку, фильтровальную бумагу, чашку Петри, лезвие бритвы с одним лезвием и цианоакрилатный клей.
- Когда температура достигнет 0-2°C, передайте раствор для нарезки в камеру нарезки (буферный лоток).
- Обезболите мышь в камере высыхания с помощью изофлурана. Точное количество может варьироваться в зависимости от размера используемой камеры, но для небольшой клетки для обувной коробки используйте несколько капель (~3-4). Оставьте мышь в клетке до тех пор, пока она не станет неподвижной (не реагируя на тактильные раздражители; около 15 секунд для описанных здесь условий). Проведите тесты на щипки хвоста и ног, чтобы убедиться, что животное глубоко обезболито, а затем обезглавьте до того, как сердце перестанет биться (повысит жизнеспособность клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии соответствующего обоснования некоторые лаборатории получают разрешение на проведение обезглавливания в реальном времени, чтобы свести к минимуму эксайтотоксические процессы и повысить жизнеспособность клеток.
- Выполните вскрытие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг должен быть извлечен быстро (<45 сек).
- С помощью скальпеля разрежьте поверхностную кожу на верхней части черепа от рострального до каудального.
- Обработайте кожу головы с каждой стороны головы.
- С помощью небольших ножниц с острым кончиком прямой разрежьте межтеменную пластину вдоль лямбдоидного шва, чтобы удалить мозжечок. Удалите затылочную кость.
- С помощью тех же ножниц разрежьте сагиттальный шов.
- Сдвиньте щипцы для канюляции сосудов (или ронжеры, если вы ломаете череп крысы) ниже каждой теменной кости и потяните, чтобы обнажить мозг.
- С помощью изогнутых гемостатических щипцов зажмите лобные кости, чтобы сломать их, затем используйте пинцет или щипцы для канюляции сосудов для удаления сломанных костей. Разрежьте и удалите твердую мозговую оболочку как можно аккуратнее, так как она может помешать рассечению.
- Проведите шпателем ниже мозга и аккуратно вытяните его из черепа. Поместите его в камеру для нарезки (буферный лоток), предварительно заполненную ледяным aCSF. Дайте мозгу остыть в течение 1-2 минут.
- Подготовьте платформу для препарирования, наполнив чашку Петри льдом и небольшим количеством ледяной воды, чтобы обеспечить больший контакт с поверхностью. Накройте посуду крышкой и положите сверху фильтровальную бумагу. Намочите фильтровальную бумагу холодным аксфом.
- Как только мозг остынет, поместите его в наполненную льдом чашку Петри и быстро выполните соответствующее рассечение, чтобы получить желаемую плоскость нарезки.
- Чтобы получить сагиттальные срезы, содержащие прилежащее ядро (NAc), используйте лезвие бритвы с одним лезвием, чтобы разрезать и удалить обонятельные бугорки и мозжечок, если они все еще присутствуют. Затем выполните сагиттальный разрез на расстоянии 2-3 мм от боковой границы правого полушария, чтобы получить плоскую поверхность, которая будет приклеена на пластину для удержания образца (см. шаг 1.8.11).
ПРИМЕЧАНИЕ: Срезание всего в 2 - 3 мм от боковой границы полусферы позволит собрать ломтики, содержащие NAc, с обоих полушарий. Подходящее рассечение будет зависеть от исследуемой области мозга. Здесь проводится диссекция, чтобы нейроны NAc могли быть зарегистрированы в сагиттальных срезах мозга.
- Быстро приклейте (с помощью цианоакрилатного клея, нанесенного на пластину для удержания образца) плоскую поверхность среза мозга на пластину в соответствии с желаемой плоскостью среза. Для получения сагиттальных срезов мозга см. шаг 1.8.10.
- Немедленно поместите и закрепите пластину для удержания образца в камере для нарезки так, чтобы мозг был разрезан ростро-каудально (для безопасности устанавливайте держатель лезвия только тогда, когда пластина для образца закреплена).
- Установите вибратом с соответствующими параметрами нарезки (параметры, используемые в лаборатории для вибратома, упомянутого в разделе Материалы: скорость 3 - 4, вибрация 9-10 и толщина среза 250 мкм).
- После среза используйте обрезанную пластиком транспортную пипетку, чтобы перенести срезы мозга в камеру восстановления (в режиме ЛТ) (см. шаг 1.3). Время восстановления может варьироваться в зависимости от исследуемого типа нейронов (обычно 30 - 90 минут).
2. Запись микропипеток и подготовка оснастки
- Обратитесь к конкретным рекомендациям руководства пользователя съемника, чтобы получить желаемые свойства микропипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для MSN мы используем диапазон сопротивления пипетки 3,2-4,0 МОм.
- Насытите кислородом аКСФ и отрегулируйте расход до 2 мл/мин. Вакуумируйте АКЧФ с помощью перистальтического насоса или вакуумных линий, установленных в учреждении.
- Включите контроллер перфузионного нагревателя и отрегулируйте настройки температуры, чтобы получить желаемую температуру (например, 31,8-32,2 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Температурная стабильность зависит от наличия как постоянного уровня aCSF, так и постоянной скорости потока в камере. Поскольку некоторые биофизические свойства нейронов (например, входное сопротивление, Ri, также называемое мембранным сопротивлением, Rm) чувствительны к температуре, важно поддерживать стабильную температуру.
- Включите усилитель с компьютерным управлением, камеру, микроманипулятор и фоновую подсветку микроскопа. При проведении эксперимента, требующего электрической стимуляции тканей, включите контроллер стимула и блок изоляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые усилители других производителей рекомендуют «прогрев» перед использованием, поэтому рекомендуется обратиться к руководству для точной процедуры работы.
- Запустите программное обеспечение для захвата камеры, сбора сигнала и усилителя.
- Размещение и визуализация слайсов:
- С помощью пластиковой пипетки для переноса с обрезанным кончиком аккуратно втяните один срез мозга из камеры восстановления.
- Поместите переводную пипетку в камеру записи и аккуратно выдавите срез из пипетки на покровную крышку, выстилающую дно камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: До тех пор, пока не происходит переполнения, безвредно, если некоторое количество аCSF из камеры восстановления попадет в ванну.
- Используйте щипцы для изменения положения среза таким образом, чтобы желаемая область располагалась точно в центре записывающей камеры. Используйте маломощный объектив микроскопа (4X) и окуляр для помощи в позиционировании.
- После того, как желаемое положение будет достигнуто, закрепите положение среза мозга с помощью прижима среза (также известного как «арфа») в камере.
- Переключитесь на объектив высокой мощности (40X) и осторожно опустите его до тех пор, пока не образуется контакт с aCSF в камере.
- Используйте колесо точной регулировки, чтобы сфокусировать ткань. При контакте с aCSF не используйте грубое юстировочное колесо на микроскопе, так как чрезмерное опускание линзы объектива может раздавить ломтик или даже сломать защитное стекло, обкладывающее дно камеры, что может привести к попаданию aCSF на конденсор и его повреждению.
- Когда фокус находится на уровне тканей, наблюдайте за клетками в целевой области на предмет формы. Мертвые клетки легко идентифицировать по их набухшей плазматической мембране и ядру (рис. 1E). Здоровые клетки должны выглядеть как круглые, яйцевидные или эллиптические однородные структуры (рисунок 1E).
- Ищите целевую клетку. Отметьте его на экране компьютера, чтобы помочь направлять записывающую микропипетку. Если вы используете программное обеспечение, такое как QCapture, нарисуйте квадрат вокруг целевой ячейки, удерживая левый щелчок мыши.
- Поднимите линзу объектива так, чтобы в конусе оставалось достаточно места в конусе, образованном линзой объектива, находящейся в контакте с aCSF, чтобы разместить и переместить записывающую микропипетку.
- Размещение и позиционирование микропипеток
- С помощью шприца объемом 1 мл, неметаллической иглы для микрошприца и специального фильтра заполните микропипетку внутренним раствором, приготовленным заранее в соответствии с запланированным экспериментом (внутренний раствор на основе К+ или Cs+, см. Материалы для состава). Используйте достаточное количество раствора, чтобы внутренний раствор соприкасался с электродом из серебряной проволоки с хлоридным покрытием внутри держателя микропипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Электрод из серебряной проволоки можно хлорировать, замочив его в бытовом отбеливателе. Нуклеозидтрифосфаты (аденозинтрифосфат, АТФ и гуанозинтрифосфат, ГТФ) могут быть добавлены внутрь раствора перед использованием. Держите шприц с раствором на льду, чтобы предотвратить деградацию АТФ/ГТФ.
- Убедитесь, что в микропипетке нет пузырьков воздуха, так как они могут выйти наружу, пока микропипетка находится в ткани, и заслонить срез.
- Поместите микропипетку в держатель электродов так, чтобы раствор соприкасался с проволочным электродом, покрытым хлоридом серебра.
- Затяните колпачок пипетки так, чтобы шайба конуса образовала уплотнение вокруг микропипетки.
- Перед погружением микропипетки в aCSF приложите положительное давление, чтобы предотвратить попадание мусора в пипетку.
- Поместите сцену в заблокированное положение (лицом к камере) и с помощью микроманипулятора направьте ее вниз к камере так, чтобы она оказалась примерно под центром погруженного объектива.
- Перемещая микропипетку с помощью микроманипулятора (установленного на среднюю и высокую скорость), используйте экран компьютера, чтобы найти микропипетку и направить ее к месту расположения ячейки по оси X-Y.
- Измерьте сопротивление микропипетки с помощью шага напряжения (например, 4 мВ в течение 100 мс), что может быть выполнено вручную или автоматически с помощью специального программного обеспечения, такого как режим «ванны», если использовать «Тест мембраны» в программном обеспечении Clampex (см. также шаг 4). Чтобы пузырьки воздуха или другие посторонние предметы не блокировали микропипетку, надавите на нее с помощью наполненного воздухом шприца (например, шприца объемом 30 куб. см), подключенного к держателю микропипетки с полиэтиленовой трубкой.
- После очистки микропипетки выполните коррекцию напряжения, чтобы снизить ток пипетки до нуля, что можно сделать вручную или с помощью специального программного обеспечения, такого как «смещение пипетки» на управляемом компьютером усилителе><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция компенсирует любое напряжение, вызванное разницей концентраций между ванной и растворами микропипеток (т.е. потенциал перехода жидкости).
3. Испытание мембраны
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг относится к усилителю, упомянутому в разделе Материалы.
- При использовании управляемого компьютером усилителя всегда устанавливайте его в режим зажима напряжения для выполнения испытания мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда испытание мембраны установлено в режиме «Ванна», испытание мембраны позволяет измерить сопротивление микропипетки и сопротивление уплотнения при формировании уплотнения.
- После разрыва мембраны (см. шаг 4.8) переключите испытание мембраны в режим «Ячейка», чтобы можно было получить последовательное сопротивление (Rs) (также называемое сопротивлением доступа, Ra), Ri и емкость мембраны (Cp).
4. Окончательный подход, формирование уплотнения и получение конфигурации целой ячейки
- Используя колесо точной фокусировки, начните фокусироваться вниз, постепенно опуская микропипетку. Всегда сначала фокусируйтесь вниз, а затем опускайте микропипетку вниз до плоскости фокусировки. Это гарантирует, что наконечник микропипетки не будет резко проникать в срез.
- Когда микропипетка соприкоснется с поверхностью среза, снизьте скорость микроманипулятора до средне-низкого режима.
- Осторожно надавите на наполненный воздухом шприц, подключенный к держателю пипетки, чтобы очистить путь приближения от мусора.
- Приближайтесь к ячейке, чередуя ручки управления X-Y-Z, или приближаясь по диагонали (если это позволяет модель микроманипулятора), где обе оси X-Z меняются вращением ручки оси Z. Последний метод предотвратит вертикальное сдавливание тканей. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь цель состоит в том, чтобы приблизиться к клетке, нанеся минимальный ущерб срезу. Когда микропипетка находится достаточно близко к клетке, появляется ямочка (круглое изменение цвета поверхности клетки, вызванное положительным давлением, оказываемым через кончик микропипетки) (рис. 2).
- Когда ямочка появится (Рисунок 2-1), примените слабое и кратковременное отсасывание через трубку, которая соединена с всасывающей трубкой держателя пипетки, чтобы создать уплотнение (Рисунок 2-2). Продолжайте следить за тестом мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образуется частичное уплотнение (<1 ГОм), подача отрицательных токов путем снижения удерживающего потенциала (на управляемом компьютером усилителе) может способствовать образованию уплотнения и достижению гигаомного сопротивления («гигаомное уплотнение» или «гигауплотнение» >1 - 5 ГОм). Высокая прочность пломбы (>1 ГОм) ограничивает шумовое загрязнение регистрируемого сигнала и способствует механической стабильности патча.
- Во время формирования гигасил используйте управляемый компьютером усилитель, чтобы максимально приблизить удерживающий потенциал клетки к физиологическому потенциалу покоя (Vrest), чтобы предотвратить резкие изменения после разрыва мембраны. Например, MSN обычно имеют напряжение от -70 или -80 мВ (физиологическоенапряжение покоя: от -70 до -90 мВ).
- После того, как гигауплотнение сформируется, компенсируйте быструю и медленную емкость вручную или автоматически. Если вы используете управляемый компьютером усилитель, такой как Multiclamp commander, нажмите «Auto» для «Cp Fast» и «Cp Slow».
- Если уплотнение остается стабильным и превышает 1 ГОм (или вводится менее 10 - 20 пА для удержания клетки на желаемом мембранном потенциале), примените кратковременное и сильное отсасывание через ту же трубку, что и при 4,5, чтобы разорвать плазматическую мембрану (рис. 2-3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого может потребоваться несколько попыток. Хороший разрыв мембраны достигается, когда всасывание выполняется достаточно сильно, чтобы разорванная мембрана не закупоривала микропипетку (что может привести к увеличению Rs во время записи), но достаточно слабо, чтобы не втягивать большую часть мембраны или клетки.
- После достижения успешной конфигурации всей ячейки регулярно контролируйте расположение микропипетки, чтобы оценить и скорректировать значительный дрейф, поскольку это может привести к потере пластыря. Амплитуда дрейфа может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, например, от качества установки установки и тяговых усилий на сцене. В идеале дрифт должен практически отсутствовать.
- Переключившись в режим «Клетка» в мембранном тесте, просмотрите различные параметры клетки, такие как Ri, Rs и Cp. Следите за этими параметрами во время записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти параметры могут помочь оценить исходное состояние здоровья клеток и типов клеток (см. раздел «Мембранный тест», шаг 4).
