$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Дифференциация rtTA/Ngn2-положительных hiPSCs в нейроны на 6-луночных MEA и стеклянных покровных стеклах
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе представлены подробности для дифференциации обратного тетрациклин-управляемого трансактиватора (rtTA)/нейрогенина-2 (Ngn2)-положительных hiPSCs на 6-луночных MEA (устройства, состоящие из 6 независимых лунок с 9 записывающими и 1 референтными встроенными микроэлектродами на лунку).
- Подготовка МПС (день 0 и день 1)
- За день до начала дифференциации простерилизовать МЭА в соответствии с рекомендацией производителя.
- Разведите белок адгезии поли-L-орнитин (PLO) в стерильной ультрачистой воде до конечной концентрации 50 мкг/мл. Покрыть площадь активного электрода 6-луночных МЭА, поместив в каждую лунку каплю разбавленного PLO объемом 100 мкл.
- Инкубируйте 6-луночные МЭА в течение ночи (O/N) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и атмосфере 5%CO2. На следующий день аспирируйте разведенный ПЛО. Дважды промойте стеклянные поверхности 6-луночных MEA стерильной ультрачистой водой.
- Разведите ламинин в холодной модифицированной Dulbecco смеси среды/питательных веществ F-12 (DMEM/F12) до конечной концентрации 20 мкг/мл. Немедленно покройте активную электродную зону 6-луночных МЭА, поместив каплю объемом 100 мкл в каждую лунку.
- Инкубируйте 6-луночные МЭА в увлажненном 37 °C инкубаторе с атмосферой 5%CO2 в течение не менее 2 часов.
- Нанесите на тарелку гиПСК (день 1)
Примечание: Объемы, упомянутые на этапах 1.2.1 - 1.2.4, предполагают, что rtTA/Ngn2-положительные hiPSCs культивируются в 6-луночном планшете и что собираются клетки одной лунки. Объемы, необходимые для гальванизации ячеек на 6-луночных МПС, зависят от количества 6-луночных МПС, используемых в эксперименте; Числа, указанные на шагах 1.2.6 - 1.2.8, позволяют масштабировать эксперимент на разные размеры.
- Подогреть DMEM/F12, раствор для отслойки клеток (CDS) и среду E8 с 1% (v/v) пенициллин/стрептомицином до R/T. Добавить доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл и ингибитор rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) в среду E8.
- Аспирируйте отработанную среду rtTA/Ngn2-положительных hiPSCs и добавьте 1 мл CDS к hiPSCs. Инкубировать 3 - 5 минут в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2. Проверьте под микроскопом, не отделяются ли клетки друг от друга.
- Добавьте 2 мл DMEM/F12 в лунку, аккуратно подвесьте клетки с помощью пипетки объемом 1000 мкл и переложите клетки в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 7 мл DMEM/F12 в клеточную суспензию. Вращайте ячейки при 200 x g в течение 5 минут.
- Отсадите надосадочную жидкость и добавьте 2 мл приготовленной среды Е8. Диссоциируйте ИПСК путем приложения кончика пипетки объемом 1000 мкл к боковой стороне пробирки объемом 15 мл и осторожного суспендирования клеток. Проверьте под микроскопом, не диссоциированы ли клетки.
- Определите количество клеток (клеток/мл) с помощью камеры гемоцитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лунка с 6 лунками в планшете с конфлюенсностью 80 - 90% обычно дает в общей сложности 3,0 - 4,0 x 106 клеток.
- Отсадите разведенный ламинин. Для 6-луночных МЭА разбавляют клетки до получения клеточной суспензии 7,5 x 105 клеток/мл. Пластинчатую обработку элементов путем добавления капли 100 мкл суспензии элемента на активную электродную область в каждой лунке 6-луночных MEA.
- Поместите 6-луночные МЭА в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2 на 2 часа.
- Через 2 ч осторожно добавьте по 500 мкл подготовленной среды E8 в каждую лунку из 6-луночных MEA. Поместите 6-луночные MEA O/N в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2.
- Смена среды (день 2)
- На следующий день приготовьте DMEM/F12 с 1% (v/v) добавки N-2, 1% (v/v) заменимых аминокислот и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина. Добавьте человеческий рекомбинантный нейротрофин-3 (NT-3) до конечной концентрации 10 нг/мл, человеческий рекомбинантный нейротрофический фактор мозга (BDNF) до конечной концентрации 10 нг/мл и доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл. Нагрейте среду до 37 °C.
- Добавьте ламинин до конечной концентрации 0,2 мкг/мл в среду. Полученную среду процедите. Отсадите отработанную среду из лунок 6-луночных МЭА и 24-луночной тарелки и замените ее подготовленной средой. Инкубируйте 6-луночные МЭА O/N в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с атмосферой 5%CO2.
- Добавить крысиные астроциты (день 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, которые упоминаются в этом протоколе, предполагают, что астроциты крыс культивируются в колбах для культуры T75. Крайне важно, чтобы астроциты крыс, которые добавляются в культуры, были хорошего качества. Мы используем два критерия, чтобы проверить, имеют ли крысиные астроциты хорошего качества. Во-первых, культура астроцитов крысы должна быть способна сливаться в течение десяти дней после выделения из эмбрионального мозга крысы. Во-вторых, после расщепления культуры астроцитов крысы, астроциты крысы должны быть способны образовывать сливающийся, мозаичный монослой. Если культура астроцитов крысы не удовлетворяет этим двум критериям, мы не советуем использовать эту культуру для экспериментов по дифференцировке.
- Нагрейте 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до RT. Нагрейте фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) и DMEM/F12 с 1% (v/v) пенициллином/стрептомицином до 37 °C.
- Аспирируйте отработанную среду культуры астроцитов крысы. Промойте культуру, добавив 5 мл DPBS, и аккуратно прополощите ее.
- Аспирируйте DPBS и добавьте 5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Осторожно взбейте трипсин-ЭДТА. Инкубировать в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2 в течение 5 - 10 минут.
- Проверьте под микроскопом, не оторвались ли клетки. Отделите последние ячейки, ударив по колбе несколько раз.
- Добавьте в колбу 5 мл DMEM/F12. Аккуратно растирайте клетки внутри колбы с помощью пипетки объемом 10 мл. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Вращайте трубку при давлении 200 x g в течение 8 минут.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл DMEM/F12. Определите количество клеток (клеток/мл) с помощью камеры гемоцитометра.
- Добавьте 7,5 x 104 астроцита в лунку 6-луночных МЭА. Инкубируйте МЭА O/N в увлажненном 37 °C инкубаторе с атмосферой 5%CO2.
- Смена среды (день 4)
- Приготовьте нейробазальную среду с 2% (v/v) добавки B-27, 1% (v/v) L-аланил-L-глутамина и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина. Добавьте NT-3 до конечной концентрации 10 нг/мл, BDNF до конечной концентрации 10 нг/мл и доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл. Кроме того, добавляют цитозин β-D-арабинофуранозид в концентрации 2 мкМ.<бр/>
Цитозин β-D-арабинофуранозид добавляется в среду для ингибирования пролиферации астроцитов и уничтожения оставшихся ИПСК ИПСК которые не дифференцируются в нейроны.
- Отфильтровать среду и нагреть до 37 °С. Отсадить отработанную среду из лунок 6-луночных МЭА и заменить ее подготовленной средой. Выдерживайте 6-луночные МЭА в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и атмосфере 5%CO2.
- Освежите медиум (день 6 - 28)<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с 6-го дня, обновляйте половину носителя каждые два дня. Начиная с 10-го дня среда дополняется фетальной бычьей сывороткой (FBS) для поддержания жизнеспособности астроцитов.
- Приготовьте нейробазальную среду с 2% (v/v) добавки B-27, 1% (v/v) L-аланил-L-глутамина и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина. Добавьте NT-3 до конечной концентрации 10 нг/мл, BDNF до конечной концентрации 10 нг/мл и доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл. Начиная с 10-го дня, также добавляйте в среду 2,5% (v/v) FBS. Полученную среду процедите и прогрейте до 37 °C.
- Удалите половину отработанной среды из лунок 6-луночных МЭА с помощью пипетки объемом 1000 мкл и замените ее подготовленной средой. Выдерживайте 6-луночные МЭА в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и атмосфере 5%CO2.
2. Установление нейрофизиологического профиля нейронов, полученных из иПСК
ПРИМЕЧАНИЕ: Через две-три недели после индукции дифференцировки нейроны, полученные из hiPSC, могут быть использованы для различных последующих анализов. В этом разделе приведены примеры некоторых последующих анализов, которые могут быть выполнены для установления нейрофизиологического профиля нейронов, полученных из hiPSC.
- Характеристика активности нейронной сети с помощью MEA
- Рекордные 20 мин электрофизиологической активности нейронов, полученных из hiPSC, культивируемых на MEA. Во время регистрации поддерживайте температуру на уровне 37 °C и предотвращайте испарение и изменения pH среды, нагнетая постоянный, медленный поток увлажненного газа (5%CO2, 20%O2, 75%N2) на MEA.
- После 1200-кратного усиления (MEA 1060, MCS) выполните выборку сигнала на частоте 10 кГц с помощью платы сбора данных MCS. Анализируйте данные (обнаружение пиков и всплесков) с помощью специального программного пакета.