$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка решений
- Стандартная искусственная спинномозговая жидкость (ACSF; Таблица 1)
- Используйте соли высокой чистоты и чистые стеклянные стаканы, предварительно промытые водой двойной дистилляции, для приготовления свежего раствора. Используйте высококачественную воду двойной дистиллированной для приготовления всех вне- и внутриклеточных растворов.
- В соответствии с таблицей 1 возьмите стакан объемом 2 л, чтобы растворить NaHCO3 в 500 мл воды, и другой, чтобы растворить другие соли, чтобы предотвратить осаждение двухвалентных ионов. Систематически очищайте шпатель дважды дистиллированной водой и высушите его перед приемом соли. Используйте магнитную мешалку для гомогенизации растворения. Добавьте растворы из обоих стаканов в соответствующую мерную колбу и доведите их до соответствующего объема.
- Убедитесь, что конечный внеклеточный раствор полностью прозрачен и не содержит следов осадка.
- Нанесите газовую смесь, состоящую из 95%O2 и 5%CO2 (карбогенный газ) со стеклянной свечой микрофильтра (Ø 13 мм) за 20 - 30 минут до перфузии ломтиков. Тщательно контролируйте осмолярность (2 - 3 последовательных измерения) ACSF с помощью осмометра (оптимальный диапазон: 314 - 325 мОсмоль/л). Оставшийся раствор после приготовления хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 3 дней.
- Режущий раствор (сахароза-ACSF; Таблица 2)
- Приготовьте 3 л свежего раствора. Используйте 1 л для приготовления срезов мозга одного животного. Храните оставшийся раствор при температуре 4 °C и используйте в течение 3 дней><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации Mg2+ и низкие концентрации Ca2+ используются для снижения синаптической передачи, а некоторое количество NaCl заменяется сахарозой для сохранения ткани.
- Внутриклеточные решения
- Заранее приготовьте раствор объемом 100 мл для двукратной записи целых клеток (табл. 3).
- Включите метилсульфат для хорошего восстановления морфологии клеток. Добавьте биоцитин (0,1 - 0,4%) для последующего изучения морфологии нейрона. Включите флуоресцентный краситель (например, Alexa 594 или Sulforhodamine 101 41), чтобы следить за расширением дендритов во время записи (по желанию).
- Заранее приготовьте раствор электрода объемом 100 мл для записи, прикрепленной к клетке (Таблица 4). В этом случае внутреннее решение представляет собой решение с высоким содержанием K+, предназначенное для изоляции макроскопического гиперполяризационно-активируемого катионного тока (Ih) и содержит блокаторы для других потенциал-зависимых ионных каналов.
- Храните внутриклеточные растворы в 2 мл аликвот при температуре -20 °C. Используйте новую аликвоту для каждого нового сеанса записи. Тщательно проверяйте осмолярность каждой размороженной аликвоты с помощью осмометра. Возьмите новую аликвоту, если осмолярность не соответствует исходному значению.
- Перелейте раствор из аликвоты в шприц объемом 3 мл, на верхнюю часть которого помещают стерильный шприцевой фильтр 0,22 мкм. Держите шприц на льду во время сеанса записи, чтобы ограничить деградацию его соединений (АТФ, ГТФ или фосфокреатина).
2. Изготовление и заполнение патч-пипетки
- вытягивание
- Используйте горизонтальный съемник электродов и толстостенную трубку из боросиликатного стекла. Для записей всей ячейки и записей, подключенных к ячейке, используйте внешний диаметр 2 мм/внутренний диаметр 1 мм. Убедитесь, что стеклянная трубка абсолютно чистая.
- Если это не так, погрузите стеклянные капилляры сначала в органический растворитель (например, этанол), а затем в воду двойной дистилляции. Кратковременно нагрейте капиллярные окончания горелкой Бунзена. В качестве альтернативы можно заказать стеклянные трубки с мытьем и подогревом непосредственно у производителя (см. Список материалов).
- Для записи двойных соматодендритных пипеток убедитесь, что сопротивление соматической пипетки составляет от 6 до 10 МОм и от 8 до 19 МОм для дендритных пипеток при заполнении внутриклеточным раствором (Таблица 3). Стандартизируйте сопротивление пипетки для записей, прикрепленных к клетке, до сопротивления 10 МОм для достижения сопоставимых результатов вдоль соматодендритного домена нейрона.
- Подготавливайте свежие пипетки перед каждым сеансом записи (каждый день) или непосредственно перед установкой коммутантов и используйте их через 5-8 часов после изготовления. Храните пипетки в закрытом стеклянном контейнере, чтобы защитить их от пыли и засорения наконечника.
- полировка
- Осмотрите и отполируйте каждый наконечник пипетки с помощью микрокузницы, чтобы получить лучшее уплотнение мембраны. Перед использованием микрокузницы расплавьте крошечный кусочек стекла на платиновой нагревательной нити. Ежедневно заменяйте это стеклянное покрытие на платиновой нити для постоянства (Питер Джонас, личное сообщение).
заметка: Пипетки, используемые для записи, подключенной к ячейке, могут быть покрыты покрытием перед этапом термополировки для снижения фонового шума. Для покрытия пипеток можно использовать изоляционное вещество, такое как расплавленный стоматологический воск или силиконовый эластомер.
3. Приготовление срезов мозга
- Используйте здоровых крыс Вистар в возрасте от 16 до 19 дней. Не используйте нездоровых животных или животных, страдающих от переохлаждения или обезвоживания. Перед началом приготовления нарезок подержите животное в безопасном и тихом месте. Избегайте присутствия в комнате других животных во время подготовки животного. Манипулируйте животными осторожно.
- Налейте сахарозу-ACSF в два стакана из полипропилена (ПП) объемом 400 мл и поместите их в морозильную камеру при температуре -80 °C на 45 мин. Смешайте раствор до получения однородного ледяного жидкого/замороженного раствора и положите стаканы на лед. Подайте в раствор сахарозы-ACSF карбоген с помощью свечи микрофильтра (Ø 13 мм) в каждом стакане из полипропилена.
- Подготовьте слайсер и резервную камеру
- Используйте высококачественный тканевый слайсер с чрезвычайно низкими вертикальными вибрациями, чтобы свести к минимуму повреждение поверхностных слоев срезов. Закрепите на слайсере свежее лезвие бритвы целиком.
- Используйте новое лезвие бритвы для каждого сеанса резки. Избегайте изгибания лезвия бритвы. Не удаляйте жировую пленку с поверхности лезвия бритвы (Йозеф Бишофбергер, личное сообщение).
- Если таковая имеется, проверьте вертикальную вибрацию с помощью виброщупа, предоставленного производителем. В качестве альтернативы можно использовать виброщуп, изготовленный на заказ. Уменьшите вертикальные колебания лезвия так, чтобы они были как можно ближе к 0 мкм.
- Подготовьте резервную камеру объемом 150 мл для ломтиков. Залейте стандартный АКСП в резервную камеру и поместите ее на водяную баню. В раствор резервной камеры подайте карбоген с помощью свечи микрофильтра (Ø 6 мм). Убедитесь, что пузырьки карбогена как можно мельче.
заметка: Стройте новую резервную камеру каждые 2-3 месяца, чтобы поддерживать постоянное качество ломтика.
- Нарезаем ломтиками
- В тихом помещении, в котором экспериментатора не тревожат и не подвергают стрессу, обезглавливают животное хирургическими ножницами (длина 150 мм) на уровне шейного мозга.
- Разрежьте скальпелем кожу на макушке головы животного в носовом и каудальном направлении и снимите ее сбоку. Разрежьте верхнюю часть черепа от хвостовой до носовой части головы тонкими ножницами и удалите обе части черепа латерально. Извлеките мозг тонким шпателем и осторожно опустите его в стакан из полипропилена, содержащий ледяную (0 - 4 °C) сахарозу-ACSF, уравновешенную карбогеном.
заметка: Эту последовательность шагов нужно выполнить как можно быстрее, но при этом скрупулезно (<<1 мин, примерно 40 с).
- Подержите мозг в растворе стакана из полипропилена от ~2 до 5 мин. Отрегулируйте давление карбогена, чтобы предотвратить движения мозга. Если пузырьки карбогена слишком крупные, замените свечу микрофильтра на свежую.
- Поместите мозг на чашку Петри диаметром 9 см, внутреннее дно которой покрыто слоем Сильгарда толщиной ~0,5 см. Приготовьте эту чашку Петри заранее.
- Окружите мозг ледяной сахарозой-ACSF. Убедитесь, что некоторая жидкая фаза раствора сахарозы растворяет мозг. При корональных срезах скальпелем или лезвием бритвы следует отрезать лобную часть мозга в корональной плоскости. Удалите мозжечок с коронковым разрезом.
- Нанесите цианоакрилатный клей на лоток для образцов (площадь ~1 см2). Вставьте блок мозга таким образом, чтобы фронтальная часть была обращена к стадии нарезки. Осторожно капните сахарозу-ACSF сверху на склеенный мозг с помощью большого отверстия стеклянной пипетки Пастера и впоследствии медленно погрузите в режущую камеру слайсера. Маневрируйте лотком для образцов так, чтобы режущая поверхность (т.е. первая ткань, попавшая на лезвие) была вентральной поверхностью мозга.
- Нанесите карбоген с помощью свечи микрофильтра из гнутого стекла (Ø 6 мм) на режущую камеру (по желанию).
- Отрегулируйте лезвие бритвы под углом ~15° относительно горизонтальной плоскости. Разрежьте корональные срезы мозга размером ~500 мкм в каудальном и носовом направлениях, прежде чем дойти до черной субстанции. Уменьшите толщину, чтобы нарезать ломтики толщиной 300 - 350 мкм, содержащие интересующую область.
- Отделите срезы от тканевого блока с помощью очень тонкой перфузионной иглы, прикрепленной к шприцу параллельно краю лезвия бритвы. Согните иглу так, чтобы между иглой и шприцем был угол 90°. Следите за тем, чтобы лезвие бритвы не оказывалось давлением во время извлечения среза из тканевого блока.
- Храните ломтики
- Перенесите дольки с помощью самого большого отверстия стеклянной пастеровской пипетки (прикрепленной к колбе) в резервную камеру. Как только все ломтики будут перенесены в резервную камеру (Кристоф Шмидт-Хибер, личное сообщение) доведите температуру водяной бани до 34 °C на 0,5 - 1 ч.
- По истечении этого срока выключите водяную баню и держите ломтики при комнатной температуре. Отрегулируйте давление карбогена во избежание движений ломтиков в резервной камере. Оставьте ломтики еще на 10–20 минут, прежде чем начать запись.
- В конце процедуры нарезки осторожно, но тщательно очистите оборудование и свечи микрофильтра водой двойной дистилляции.
4. Двойная соматическая и соматодендрическая записи в нейронах Ниграла и биоцитиновая регистрация
- Ниже приведены описания сборки патч-зажимов для срезов, приведенные в Руководстве по аксонам.
- Подготовьте камеру записи
- Налейте в камеру записи 1 - 2 мл дважды дистиллированной воды. Убедитесь, что он не протекает. Поместите записывающую камеру на сдвигающийся x-y стол.
- Стандартная ACSF подается через непроницаемую для кислорода систему перфузионных трубок (политетрафторэтилен) в записывающую камеру. Стабилизировать перфузионный поток в камере со скоростью 4 - 5 мл мин-1. Длина трубки, соединяющей стакан, содержащий ACSF, и записывающую камеру должна быть как можно короче (1 м).
- Выберите срез мозга из резервной камеры и перенесите его в записывающую камеру с помощью самого большого отверстия стеклянной пастеровской пипетки. Накройте срез платиновым кольцом, чтобы закрепить его на дне записывающей камеры. Используйте плоское платиновое кольцо (Ø 1,5 см) и приклейте на него параллельные капроновые нити (расстояние >2 мм).
- Настройка и оптимизация оптики
- Визуализируйте срезы с помощью инфракрасной (ИК) видеомикроскопии. Отрегулируйте подсветку Köhler 51 и оптимизируйте дифференциально-интерференционную контрастную оптику (DIC) или косое освещение (градиентный контраст Додта - DGC).
- Проверьте качество ломтика. Оставляйте только срезы с гладкой и ровной поверхностью, которые не слишком сильно контрастируют и имеют только небольшие, рассеянные кратеры.
- Заполните 2 свежие и неиспользованные патч-пипетки внутриклеточным раствором (табл. 3). Используйте пробирку объемом 0,5 мл, содержащую раствор для пипетки, чтобы заполнить кончик пипетки за счет капиллярного действия. Чтобы ускорить наполнение наконечника пипетки без нити, приложите отрицательное давление к концу пипетки с помощью трубки, прикрепленной к шприцу.
- Расположите пипетки над поверхностью среза
- Проверьте наличие хлористого налета на серебряных проводах.
- Вставьте пипетки последовательно в держатели для пипеток и подайте положительное давление (~70 мбар) с помощью трубки, соединяющей держатель пипетки, трехсторонний кран и манометр. Опустите пипетку в ванну записывающей камеры.
- Убедитесь, что значение давления на манометре остается постоянным в течение ~1 - 2 минут. Если давление снижается, проверьте трубку или уплотнительные кольца внутри держателя пипетки.
- Поместите наконечник пипетки в середину видеомонитора и убедитесь, что он не загораживается. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки не двигался при приложении или ослаблении давления на пипетку.
- Проверьте дрейф и вибрации наконечника пипетки, нарисовав небольшой крестик в центре монитора точно в месте расположения наконечника пипетки, и в течение 5 минут наблюдайте за возможными движениями наконечника.
- Подайте ступень напряжения (5 мВ) для контроля сопротивления пипетки на осциллографе. Установите удерживающий потенциал усилителя с патч-зажимом на 0 мВ. Отмените возможность смещения пипетки таким образом, чтобы ток пипетки постоянного тока показывал ноль на измерителе усилителя.
- Переместите пипетки вниз к срезу и держите их над поверхностью.
- Выбрать и запатчить нейрон с длинными дендритами
- В пределах черной субстанции выберите здоровый нейрон с длинными дендритами, за которыми можно следить на большом расстоянии примерно в одной и той же плоскости (рис. 1А и 1В) с помощью градиентного контраста IR-DODT (IR-DGC). Выбирайте гладкое и однородное тело клетки. Избегайте двух сильно контрастных ячеек на поверхности среза (рис. 1C и 1D), поскольку их трудно взломать и сохранить стабильные условия записи с течением времени (стабильное последовательное сопротивление). Выберите нейроны, у которых сома находится на расстоянии 10 - 30 мкм ниже поверхности среза.
- Переместите соматический электрод близко к соме (на расстоянии 40 - 50 мкм), а дендритный электрод - близко к дендриту на такое же расстояние. Используйте 2-кратное увеличение (четырехкратный чейнджер) для выбора и исправления части дендрита. Получите на мониторе абсолютное увеличение 2,100X без увеличения (1X) и 5,500X с 2-кратным увеличением.
- Немного ослабьте давление соматической пипетки на 10 мбар. При необходимости регулируйте давление дендритной и соматической пипетки, чтобы избежать смещения клеточной структуры (сомы и дендрита) внутри среза.
- Расположите дендритную пипетку близко к мембране, чтобы увидеть небольшую ямочку. Ослабьте давление на наконечник пипетки и заплатите дендрит, контролируя сопротивление пипетки. В идеальных условиях для получения хорошего уплотнения достаточно лишь очень небольшого всасывания.
- Уменьшите амплитуду емкостных переходных процессов пипетки как можно сильнее шага тока с помощью импульса напряжения с высоким коэффициентом усиления и небольшой фильтрацией 51 и осциллографа. Войдите в режим обработки целых клеток с помощью дендритной пипетки.