Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Электрофизиологические записи для исследования спонтанной и зависящей от электродной стимуляции активности
- Промойте культуру многоэлектродной матрицы (МЭА) внеклеточным раствором при комнатной температуре (ОТ).
- Высушите контакты салфеткой и установите MEA на установку MEA.
заметка: Чтобы культура оставалась влажной во время монтажа, добавьте в культуру небольшую каплю внеклеточного раствора.
- Добавьте 300 μл внеклеточного раствора и подождите 10 минут перед записью, чтобы дать системе стабилизироваться.
- Записывайте спонтанную активность в течение 2 минут со всех электродов нажатием кнопки записи/захвата программного обеспечения и идентифицируйте записывающие электроды.
- Стимуляция электродами MEA: Выберите амплитуду/продолжительность/форму стимула в соответствующем программном обеспечении и примените его к нескольким электродам последовательно. Подбирайте электроды исходя из тех, которые проявляют спонтанную активность (как в шаге 1.4). Запись со всех оставшихся электродов.
- Чтобы исключить артефакт стимуляции, стимулируйте от одного и того же электрода 10 раз. Если бактериологическое исследование реагирует по крайней мере в 8 из 10 раз, можно предположить, что это положительный ответ на стимуляцию, индуцированную электродами.
- Для идентификации фонового шума нанесите на культуру тетродотоксин (ТТХ) в концентрации 1 мкМ, чтобы заблокировать потенциал-зависимые натриевые каналы, и записывайте в течение 2 мин. Используйте его для детектирования спайков (2.1 и 2.2).
2. Анализ данных
- С помощью соответствующего программного обеспечения можно обнаружить спонтанную активность для каждого электрода с помощью детектора на основе стандартных отклонений и последующего дискриминатора. Активность проявляется в виде быстрых переходных процессов напряжения (<5 мс).
- Выберите пороговое значение, при котором при анализе обработанных образцов TTX не будет никаких действий. Настройте пороговое значение для каждого эксперимента, чтобы различать ложноположительные и ложноотрицательные обнаружения.
- С помощью соответствующего программного обеспечения наблюдайте за обнаруженной нейронной активностью каждого электрода в виде растрового графика в соответствии со стандартными процедурами (см. рис. 1A-C).
- Определяйте и отображайте общую сетевую активность путем суммирования всех обнаруженных событий в пределах скользящего окна в 10 мс, смещенного на 1 мсек.
- Выявляйте активность, вызванную стимуляцией, отображая необработанные данные с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа. Определите одиночные всплески в автономном режиме вручную. Одиночные всплески проявляются в виде быстрых переходных процессов напряжения, возникающих после артефакта стимуляции (стрелка на рисунке 1E). Пример показан на рисунке 1E.
- В зависимости от эксперимента проанализируйте количество реагирующих электродов, порог, необходимый для достижения отклика, количество потенциала действия на электроды и другие интересующие параметры.
