Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый участник, участвующий в процедуре, должен быть должным образом обучен основным хирургическим процедурам и должен иметь действующую лицензию на проведение экспериментов на животных.
1. Анестезия и премедикация
- Обезболить крыс внутрибрюшинными инъекциями пентобарбитала натрия (начальная доза 60 мг·кг-1 для 6-месячных самцов крыс линии Wistar массой 400\u2012550 г).
заметка: Этот протокол не ограничивается указанной линией, полом или возрастом крыс. Кроме того, альтернативные методы анестезии, такие как смесь кетамина-ксилазина, альфа-хлоралозы или фентанил+мидазолам+медетомидин, могут быть использованы, если это больше подходит для различных исследовательских целей или когда этого требует комитет по этике.
- Примерно через 5 минут проверьте глубину анестезии, зажав задний палец ноги крысы тупыми щипцами. Приступайте к следующим шагам протокола только тогда, когда не наблюдается рефлекторного действия.
- Введите 0,05 мл атропина подкожно, чтобы уменьшить выработку слизи после интубации.
- Подкожно вводят 5 мл фосфатного буфера, содержащего 4% раствор глюкозы, NaHCO3 (1 %) и желатин (14 %). Этот буфер будет поглощаться кожными сосудами на протяжении всего эксперимента и поможет поддерживать баланс жидкости.
- На протяжении всей операции периодически проверяйте животное на предмет рефлекторного действия и при необходимости дополняйте анестезию (10 мг·кг-1·ч-1 пентобарбитала натрия).
2. Хирургия
- Подготовьте животное к хирургическому лечению путем сбривания шерсти над спинной частью левой задней конечности, от лодыжки до бедра, задней частью, от хвоста до высоких грудных сегментов (Th), левой стороной грудной клетки и вентральной стороной области шеи над грудиной
- Установка внутривенной капельницы
- Положите крысу на спину на грелку с замкнутым контуром (и закрепите ее фиксацией конечностей).
- С помощью 21-го лезвия сделайте продольный разрез кожи от грудины до подбородка.
- Удерживайте кожу щипцами и отделите ее от подлежащих тканей.
- Используя техники тупого рассечения, обнажите правую яремную вену. Аккуратно рассеките вену от окружающих тканей.
- Найдите часть вены без точек разветвления и просуньте под нее две лигатуры 4-0.
- Сделайте один свободный узел на проксимальном конце ранее выявленного неветвящегося сегмента вены и один свободный узел на дистальном конце этого сегмента вены. Зажмите вену проксимальнее сердца, а затем переложите дистальную часть вены.
- С помощью ножниц для радужной оболочки глаза сделайте надрез между зажимом и дальней лигатурой. Возьмитесь за лоскут вены и введите предварительно заполненный катетер в точку, где он заблокирован зажимом.
- Удерживая вену и катетер вместе щипцами, снимите зажим и протолкните катетер на несколько миллиметров внутрь вены. Закрепите оба конца катетера в вене и добавьте дополнительную точку фиксации к коже.
3. Введение трахеальной трубки
- С помощью тупых щипцов отделите две нижнечелюстные железы, покрывающие грудиновидные мышцы. Отделите грудиноягодные мышцы по средней линии, чтобы обнажить трахею.
- Проведите три лигатуры 4-0 под трахею, затем сделайте два узла ниже точки введения трахеальной трубки и один узел выше.
- Найдите перстневидный хрящ гортани и сделайте разрез ниже третьего трахейного хряща.
- Введите трахеальную трубку вниз по трахее и закрепите трубку на месте с помощью заранее подготовленных лигатур, затем добавьте дополнительную лигатуру на кожу.
- Поместите небольшой кусочек ваты над отделенными мышцами и зашите кожу над прооперированной областью.
4. Рассечение нервов задних конечностей
- С помощью лезвия 21 сделайте продольный надрез на задней стороне левой задней конечности, от ахиллова сухожилия до бедра.
- Захватите кожу щипцами и, используя тупые методы препарирования, отделите кожу от подлежащих мышц по обе стороны разреза.
- Расположите подколенную ямку в задней части коленного сустава, который закрыт двуглавой мышцей бедра, и с помощью ножниц сделайте надрез между передней и задней частью этой мышцы.
- Двигаясь вверх, разрежьте две головки двуглавой мышцы бедра до самого бедра, чтобы обнажить седалищный нерв. Прижигайте по мере необходимости, чтобы предотвратить кровотечение.
- Определите суральную, большеберцовую и общую малоберцовую ветви седалищного нерва.
- С помощью ножниц отделите боковую головку икроножной мышцы от медиальной, чтобы обнажить большеберцовый нерв и его ветви.
- С помощью 55 щипцов захватите дистальный конец икроножного нерва, разрежьте его дистально и рассеките как можно дальше.
- Повторите процедуру с общим малоберцовым нервом.
- С помощью стержня из тупого стекла отделите большеберцовый нерв от окружающих тканей, стараясь не повредить кровеносные сосуды, и разрежьте его дистально.
- Определите медиальный икроножный нерв (MG) и латеральный икроножный и камбаловидный нервы (LGS).
- С помощью 55 щипцов осторожно рассеките нервы MG и LGS, отсоединив их от окружающих тканей, но сохранив их связь с соответствующими мышцами.
- Подложите пропитанный солевым раствором кусочек ваты под обнаженные нервы.
- Закройте кожу над прооперированной областью.
5. Ламинэктомия
- С помощью лезвия на 21 очко сделайте продольный разрез от крестца до грудных позвонков.
- Отделите кожу от подлежащих мышц.
- Разрежьте длинную мышцу с обеих сторон грудного и поясничного остистых отростков.
- С помощью скальпеля с тупыми краями втяните мышцы от позвоночного столба, чтобы обнажить поперечные отростки каждого позвонка.
- С помощью ножниц с тупым кончиком разрежьте сухожилия мышц, соединенных с поперечными отростками по обнаженному позвоночному столбу. При необходимости применяйте кровоостанавливающие средства.
- Определите позвонок Th13 как самый нижний грудной сегмент с прикреплением ребер и, используя тонкие ронжеры, удалите остистые отростки и пластинки от позвонков Th13 до L2, чтобы обнажить поясничные сегменты спинного мозга. Помните, что нельзя повредить остистый отросток L3, который будет использоваться в качестве точки фиксации для стабилизации позвоночника.
- Удалите остистый отросток Th12 и максимально разгладьте дорсальную поверхность позвонка.
- Используя технику тупого препарирования, отделите мышцы от позвонка Th11, чтобы создать точки прикрепления держателя.
- Положите тонкую, пропитанную солевым раствором вату на открытые сегменты спинного мозга.
- Переместите крысу на изготовленную на заказ металлическую раму с двумя параллельными перекладинами и двумя регулируемыми руками с зажимами для поддержки и стабилизации позвоночника.
6. Подготовка к записи и стимуляция
- Фиксация позвоночного столба и расположение нервов
- Поместите крысу в специально изготовленную раму на грелку, подключенную к замкнутой системе обогрева, чтобы поддерживать температуру тела животного на уровне 37 ± 1°C.
- Вставьте электроды электрокардиограммы (ЭКГ) под кожу и подключите к усилителю для мониторинга сердечного ритма.
- С помощью кожных лоскутов сформируйте глубокую лужу над обнаженным спинным мозгом.
- С помощью металлических зажимов зафиксировать позвоночный столб, поставив зажимы ниже поперечных отростков Th12 и на L3 остистого отростка.
- Убедитесь, что позвоночный столб закреплен и расположен горизонтально, а затем приложите дорсо-вентральное давление с обеих сторон столба, чтобы втянуть мышцы.
- Наполните бассейн теплым (37 °C) минеральным маслом и поддерживайте в нем эту температуру.
- Проденьте лигатуру 4-0 через ахиллово сухожилие, поднимите и растяните прооперированную левую заднюю конечность так, чтобы лодыжка оказалась на одном уровне с бедром.
- С помощью кожных лоскутов сделайте глубокую лужу над обнаженными большеберцовыми, MG и LGS нервами.
- Наполните бассейн теплым (37 °C) минеральным маслом.
- Поместите нервы MG и LGS на биполярные электроды со стимуляцией серебряной проволокой и подключите их к квадратному импульсному стимулятору. Используйте отдельные каналы стимуляции для каждого нерва.
7. Размещение поверхностных электродов
- Поместите серебряный шариковый электрод на левую каудальную сторону обнаженного спинного мозга, а электрод сравнения вставлен в мышцы спины, и подключите оба электрода к дифференциальному усилителю постоянного тока. Поверхностный шаровой электрод будет использоваться для записи афферентных залпов от нервов.
- С помощью стимулятора постоянного тока стимулируйте нервы МГ и ЛГС квадратными импульсами длительностью 0,1 мс, повторяющимися с частотой 3 Гц, и наблюдайте за афферентными залпами.
- Определите порог (Т) для активации нерва, стимулируйте каждый нерв с интенсивностью примерно 3·Т и запишите амплитуду афферентного залпа для каждого нерва.
- Переместите поверхностный электрод в ростраль и повторите процедуру для определения сегментов позвоночника, на которых амплитуды залпов являются наибольшими для каждого нерва. После определения максимального места залпа переместите поверхностный электрод на безопасное расстояние от спинного мозга.
- Паралич мышц и формирование пневмоторакса с целью уменьшения дыхательных движений
- Парализовать крысу внутривенно с помощью нервно-мышечного блокатора и подключить трахеальную трубку к внешнему аппарату искусственной вентиляции легких в соответствии с капнометром, совместимым с грызунами (Pancuronium bromide, в начальной дозе 0,4 мг·кг-1, добавляемый каждые 30 минут в дозе 0,2 мг·кг-1)
- Контролируйте концентрациюCO2 в конце прилива и поддерживайте ее на уровне около 3\u20124%, регулируя параметры вентиляции (частоту, давление воздуха и объемы потока).
- Сделайте продольный разрез на коже между 5-м и 6-м ребрами со стороны записи.
- С помощью ножниц с тупым кончиком разрежьте вышележащие мышцы, чтобы визуализировать межреберье между ребрами.
- С помощью маленьких острых ножниц сделайте небольшой разрез в межреберных мышцах и в области плевры, затем введите кончик щипцов с тупым краем в отверстие, стараясь не давить на легкие.
- Дайте щипцам расшириться или вставьте небольшую трубку, чтобы держать пневмоторакс открытым на протяжении всего эксперимента.
- После нервно-мышечной блокады контролируйте глубину анестезии, проверяя частоту ЭКГ, и дополняйте анестетик, если частота сердечных сокращений превышает 400 уд/мин. Паралич мышц и формирование пневмоторакса для уменьшения дыхательных движений, что улучшит стабильность записи.
8. Вскрытие твердой мозговой оболочки и пиа mater
- С помощью щипцов #55 аккуратно приподнимите твердую мозговую оболочку и разрежьте ее каудально от сегмента L5, рострально вверх до сегмента L4.
- С помощью пары ультратонких щипцов 5SF сделайте небольшой пластырь в пиа, охватывающий дорсальный столб между кровеносными сосудами, точно на уровне максимального афферентного залпа от МГ или нерва ЛГС.
- При необходимости используйте небольшие кусочки пропитанной солевым раствором и высушенной гелевой пены, чтобы остановить кровотечение.
9. Трансспинальная стимуляция постоянным током (tsDCS) размещение электродов
- Сделайте небольшой разрез на коже на вентральной стороне живота крысы на рострокаудальном уровне, соответствующем расположению поясничных (L)4-L5 позвоночных сегментов.
- Возьмитесь за открытый кожный лоскут металлическим зажимом, который будет служить электродом сравнения.
- Положите смоченную солевым раствором губку на дорсальную сторону грудного (Th) 12 позвонка. Следите за тем, чтобы размер губки был равен размеру активного электрода tsDCS (круглая пластина из нержавеющей стали диаметром 5 мм).
- С помощью тонкого манипулятора прижмите губку с активным электродом tsDCS к кости и убедитесь, что вся поверхность электрода прижата одинаково.
- Подключите электроды сравнения и активные электроды tsDCS к блоку стимулятора постоянного тока, способному выдавать непрерывный поток постоянного тока.
10. Приготовление микропипеток
- С помощью съемника микроэлектродов подготовьте микроэлектрод.
заметка: Можно использовать как филаментные, так и нефиламентные электроды. Однако помните, что хвостовик электрода должен быть достаточно длинным, чтобы доставать до брюшного рога, и в то же время достаточно тонким, чтобы не сдавливать спинной мозг при опускании.
- Отрегулируйте настройку съемника таким образом, чтобы длина стержня, входящего в спинной мозг, составляла примерно 3 мм, при этом диаметр кончика электрода составлял не более 1\u20122 мкм, а сопротивление микроэлектрода — от 10 до 20 МОм.
- Заполните микроэлектроды 2М калий-цитратным электролитом.
- Установите подготовленный микроэлектрод на микроманипулятор, обеспечив ступенчатое движение с шагом 1\u20122 мкм и стереотаксическую калибровку.
- Подключите микроэлектрод к внутриклеточному усилителю с помощью электрода сравнения, помещенного в мышцы спины.
- После нервно-мышечной блокады контролируйте глубину анестезии, проверяя частоту электрокардиограммы (ЭКГ), и дополняйте обезболивающее средство так, чтобы частота сердечных сокращений крысы не превышала 400 уд/мин.
11. Отслеживание и проникновение мотонейронов
- Поместите электрод для записи афферентного залпа обратно на дорсальную поверхность спинного мозга, каудально к месту записи, на уровне сегмента L6.
- Стимулируйте медиальный икроножный нерв (МГ) и латеральный икроножный и камбаловидный нервы (ЛГС) электрическими импульсами продолжительностью 0,1 мс с частотой 3 Гц и интенсивностью 3 Тл, чтобы активировать все аксоны альфа-мотонейронов в пределах выбранного нерва.
- Введите микропипетку в выбранный участок в пиа с медиолатеральным углом 15\u201220° (с наконечником, направленным в сторону).
- После спуска под поверхность откалибруйте микроэлектрод и компенсируйте его емкость и смещение напряжения, а также продолжайте проникновение в спинной мозг, когда все параметры стабилизируются. Потенциал антидромного поля пула мотонейронов будет виден на трассе напряжения микроэлектродов при приближении к специальному моторному ядру во время стимуляции соответствующего нерва.
- Продолжайте проникновение микроэлектродом с шагом 1\u20122 мкм и периодически используйте функцию жужжания внутриклеточного усилителя, чтобы очистить наконечник электрода от любых остатков.
- Наблюдайте за проникновением мотонейрона, которое будет характеризоваться внезапной гиперполяризацией регистрируемого следа напряжения и появлением антидромного спайкового потенциала.
12. Запись мембраны мотонейрона и свойств обжига
- В мостовом режиме внутриклеточного амплификатора идентификацию мотонейрона, исходя из появления антидромного потенциала действия по принципу «все или ничего» путем стимуляции соответствующих нервных ветвей. Запишите 20 последующих трассировок для последующего усреднения.
- Внедрить строгий критерий включения для обеспечения высокого качества данных: мембранный потенциал покоя не менее -50 мВ по амплитуде; амплитуды потенциала действия более 50 мВ, с положительным выбросом; мембранный потенциал, стабильный в течение не менее 5 мин до записи.
- В режиме прерывистого тока-зажима (режим скорости переключения тока 4–8 кГц) внутриклеточного усилителя вызвать ортодромный потенциал действия в мотонейроне с помощью импульсов внутриклеточного деполяризующего тока длительностью 0,5 мс. Повторите не менее 20 раз для усреднения в автономном режиме.
- Стимулируйте мотонейрон 40 короткими импульсами (100 мс) гиперполяризационного тока (1 нА) для расчета входного сопротивления клетки.
- Стимулируйте мотонейрон прямоугольными импульсами длительностью 50 мс с возрастающей амплитудой, чтобы определить значение реобазы как минимальную амплитуду деполяризационного тока, необходимую для возникновения одного скачка.
- Впрыскивание прямоугольных импульсов деполяризующего тока длительностью 500 мс с возрастающей амплитудой с шагом 0,1–2 нА для вызова ритмичных разрядов мотонейронов.
13. Трансспинальная стимуляция постоянным током (tsDCS)
- Сохраняя стабильное проникновение мотонейрона, начните процедуру поляризации путем трансспинального приложения постоянного тока. Отрегулируйте текущую интенсивность и время применения в соответствии с планом эксперимента (например, 0,1 мА в течение 15 минут).
- Сразу после включения постоянного тока наблюдайте за потенциалом мембраны мотонейрона. Анодная поляризация (активный электрод в качестве анода) должна приводить к деполяризации мембранного потенциала, в то время как катодная поляризация (активный электрод в качестве катода) должна вызывать противоположный эффект. Наблюдайте, является ли изменение потенциала мембраны покоя в ответ на стимуляцию постоянным током, что гарантирует, что интенсивность электрического поля не изменяется.
- При подаче постоянного тока повторяйте шаги 5,3\u20125,6 с интервалом в 5 минут.
- Выключите контроллер переменного тока и продолжайте повторять шаги 5.3\u20125.6 с интервалом в 5 минут, пока запись не станет нестабильной или не будут нарушены критерии включения.
- Прекратить эксперимент и усыпить животное с помощью внутривенного введения смертельной дозы пентобарбитала натрия (180 мг·кг-1).
awy Sp. z o.o