Подача шумовых токов на медиальные нейроны вестибулярного ядра с помощью метода Whole-Cell Patch-Clamp

Аннотация

Источник: Stefani, S. P., et al. Применение стохастического шума для оценки чувствительности нейронов медиального вестибулярного ядра in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует протокол, включающий применение подпороговых шумовых токов к медиальным нейронам вестибулярного ядра с использованием метода целоклеточного патч-clamp для изучения влияния шумовых токов на чувствительность нейронов к электрическим стимулам.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Животные

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были получены из Австралийского центра грызунов (ARC; Перт, Австралия) и проводились в Медицинском фонде Building Animal Facility при Сиднейском университете.

1. Поддерживайте мышей в стандартном 12-часовом цикле свет/темнота с обогащением окружающей среды.
2. Для всех экспериментов используйте самцов и самок мышей C57BL/6 (возрастом 3–5 недель).

2. Приготовление растворов

1. Приготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости (АКСФ) в составе 29 мМ NaHCO₃, 11 мМ глюкозы, 120 мМ NaCl, 3,3 мМ KCl, 1,4 мМ₂PO₄, 2,2 мМ MgCl₂, 2,77 мМ CaCl₂.
2. Приготовьте 200 мл сахарозы-ACSF (sACSF), содержащей 29 мМ NaHCO₃, 11 мМ глюкозы, 241,5 мМ сахарозы, 3,3 мМ KCl, 1,4 мМ₂PO₄, 2,2 мМ MgCl₂, 2,77 мМ CaCl₂. Перед добавлением CaCl₂ в ACSF и sACSF отравите растворы карбогеном (95 %_O2 и 5 % CO₂) для достижения pH 7,4 и предотвращения осаждения кальция (помутнения).
3. Приготовьте внутриклеточный раствор на основе К⁺, состоящий из 70 мМ глюконата калия, 70 мМ KCl, 2 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, 4 мМ EGTA, 4 мМ Mg_2-АТФ, 0,3 мМ Na_3-GTP, с конечным pH 7,3 (скорректировано с помощью KOH).
   заметка: Внутриклеточные растворы рекомендуется фильтровать с помощью фильтров 0,22 мкм и хранить в аликвотах 0,5 мл при -20 °С.

3. Подготовка ствола мозга

1. Перед экстракцией ствола мозга уравновесьте sACSF с карбогеном и охладите до -80 °C в течение 25 минут до образования ледяной суспензии.
2. Обезболить мышь изофлураном (3–5 %), насыщенным кислородом (3 мл/мин). Как только рефлексы задней лапы исчезнут, обезглавьте мышь острыми ножницами из нержавеющей стали.
3. Обнажите череп, сделав сагиттальный разрез на коже с помощью лезвия бритвы (#22 закругленный).
4. С помощью заостренного конца ножниц стандартного образца сделайте небольшой надрез у лямбды и разрежьте вдоль продольной щели.
5. Тщательно отразите парные теменные и затылочные кости с помощью пары неглубоких изгибов Pearson rongeur.
   заметка: Во время этой процедуры мозг непрерывно омывается на месте с использованием заранее приготовленной ледяной суспензии sACSF.
6. Отделите ствол мозга от переднего мозга и его костной оболочки с помощью бритвенного лезвия (#11 прямой), чтобы вырезать теменно-затылочную борозду и каудальное мозговое вещество.
7. Закрепите изолированный вентральный конец ствола мозга на предварительно вырезанном трапециевидном полистирольном блоке. С помощью фитиля папиросной бумаги удалите лишнюю жидкость вокруг рассеченной ткани и обеспечьте хорошую адгезию тканей к стадии разреза.
   заметка: Полистирольный блок разрезается в трапециевидной форме, чтобы обеспечить прилегание рострального конца среднего мозга и сужение к спинному мозгу.
8. С помощью цианоакрилатного клея закрепите полистирольный блок с прикрепленным ростральным концом ствола мозга вплоть до стадии резки.
9. Используя скорость опережения 0,16 мм/с и амплитуду вибрации 3,00 мм, приготовьте поперечные срезы MVN.
   длиной 200 мкм заметка: Местоположение MVN определяется с помощью атласа мозга мышей Paxinos and Franklin. MVN (указанная в атласе как MVe) лежит непосредственно вентролатерально от 4-го желудочка и является самой большой прямо перед прикреплением мозжечка (между нижними колликулами и обексом).
10. С помощью пипетки, обрезанной пластиком, переложите срезы на диск из фильтровальной бумаги, находящийся в карбогенированной ACSF при температуре 25 °C, в течение не менее 30 минут перед записью.

4. Инструменты

1. Используйте стандартную электрофизиологическую установку для выполнения техники зажима целых клеток.
2. Подготовьте микропипетки по двухэтапному протоколу (этап нагрева 1: 70; этап нагрева 2: 45) на съемнике микропипеток (см. Таблицу материалов).
3. При помещении в ванну микропипетки должны иметь конечное сопротивление в диапазоне от 3 до 5 МОм с внутренним раствором.
   заметка: Используемые настройки могут варьироваться в зависимости от температуры в помещении и могут меняться довольно часто.

5. Электрофизиология зажима для целых клеток

1. Для получения записей клеточного зажима от отдельных нейронов в MVN используется внутреннее решение на основе K+ внутри записывающей пипетки.
2. Перенесите один срез ткани из инкубационной камеры в камеру записи и закрепите его с помощью нейлоновой нити на-образном грузике. Непрерывно перфузируйте записывающую камеру карбогенированным ACSF при температуре 25 °C при расходе 3 мл/мин.
3. После наполнения микропипетки внутренним раствором найдите МВН с помощью маломощной (10-кратной) линзы объектива. Используя объектив высокой мощности (40x), можно расположить отдельные нейроны в MVN.
   заметка: Качество ячейки имеет важное значение для обеспечения качества записи и долговечности ячейки при попытке достичь конфигурации всей ячейки. Подходящая клетка должна демонстрировать сферическую форму, отражающую клеточную мембрану и невидимое ядро. Неподходящая клетка будет иметь большое видимое ядро (похожее на яйцо) и опухший/сморщенный вид.
4. Прежде чем прорвать ткань пипеткой, приложите небольшое положительное давление, чтобы оттолкнуть мусор от наконечника пипетки.
5. Переместите пипетку с помощью микроманипулятора в сторону выбранного нейрона, и на мембране нейрона должна образоваться небольшая ямочка.
   Сбросьте положительное давление и приложите небольшое количество отрицательного давления.
6. После того, как будет достигнуто уплотнение 1 ГОм, мягкое, короткое и резкое отрицательное давление надавите на держатель пипетки через всасывающее отверстие, чтобы разорвать мембрану и создать конфигурацию всей клетки.
7. Выполняйте запись токовых клещей всей ячейки с помощью стандартных методов.

6. Применение синусоидального и стохастического шума к отдельным нейронам медиального вестибулярного ядра

1. Применяют стохастический и синусоидальный шум в диапазоне амплитуд от 3 до 24 пА для определения порога нейронов и частоты возбуждения.
2. Определите сенсорный порог, сгруппировав более низкие и более высокие интенсивности стимулов, и выполните ANOVA для наблюдения за любыми различиями (как показано на рисунке 1).
3. Рассчитайте среднюю скорость срабатывания за период 10 с, в течение которого был введен или будет введен шаг деполяризующего тока для каждого отдельного уровня тока (т.е. всего 7 эпизодов; Рисунок 2).
4. Используйте средние значения скорости срабатывания для получения коэффициента срабатывания по отношению к текущему графику и выполните линейный регрессионный анализ, чтобы определить градиент линии наилучшего соответствия. Градиент линии наилучшего соответствия указывает на прирост нейронов.

Результаты

Рисунок 1: Объективное определение порога 12 пА. Скорости возбуждения для менее 12 пА (3 и 6 пА) и более 12 пА (18 и 24 пА) были объединены и усреднены. Затем эти средние значения были проанализированы с использованием ANOVA и статистической значимости между фиктивным и >12 пА и между <12 пА и >12 пА. *p < 0,05.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CaCl2	Шарлау	CA01951000	Используется для ACSF и sACSF
D-(+)-глюкоза	сигма	Г8270	Используется для ACSF и sACSF
ЭГТА	сигма	Э0396-25Г	Используется для внутриклеточного решения на основе K
ХЕПЕС	сигма	Н3375-25Г	Используется для внутриклеточного решения на основе K
KCl	Химическое снабжение	ПА054-500Г	Используется для ACSF, sACSF и внутриклеточного раствора
К-глюконат	сигма	П1847-100Г	Используется для внутриклеточного решения на основе K
Мг-АТФ	сигма	А9187-500МГ	Используется для внутриклеточного решения на основе K
MgCl	Химическое снабжение	MA00360500	Используется для ACSF и sACSF
Na 3-ГТП	сигма	Г8877-100МГ	Используется для внутриклеточного решения на основе K
NaCl	Химическое снабжение	SO02270500	Использование для ACSF и внутриклеточного раствора
2PO4.2H 2O	Аякс	АДЖА471-500Г	Используется для ACSF и sACSF
НаОГС3	сигма	С5761-1КГ	Используется для ACSF и sACSF
сахароза	Химическое снабжение	СА030-500Г	Используется для sACSF
Изофлуран	Генри Шейн	1169567762	Используется для обезболивания мышей
оборудование
Капилляры из боросиликатного стекла	Инструменты Warner	ГК150Т-7,5	Внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 1,16 мм, 7,5 см<бр /> длина
Программное обеспечение для сбора данных	Аксограф		Используется для электрофизиологии и анализа
Фридмен-Пирсон Ронгер	Мировые прецизионные приборы	14089	Используется для вскрытия
Съемник микропипеток	Нарисигэ	ПП-830	Используется для микропипеток
Усилитель Multiclamp	Инструменты Axon	700В	Используется для электрофизиологии
pH-метр	Научный Спер	860033	Используется для внутреннего решения
Стандартные ножницы	ФСТ	14028-10	Используется для вскрытия
Микроманипулятор Саттера	Саттер	МП-225/М	Используется для электрофизиологии
Вертикальный микроскоп	Олимп	BX51WI	Используется для электрофизиологии
Вибратом	Лейка	ВТ1200	Используется для среза мозговой ткани