Определение уровня перекиси водорода в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентной визуализации живых клеток

Аннотация

Источник: Terzi, A. et al., Визуализация живых клеток ROS во время развития нейронов.J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует метод определения уровня перекиси водорода в ганглиозных клетках сетчатки в реальном времени с помощью биосенсора roGFP2-Orp1 и методов визуализации живых клеток. В нем описаны этапы, связанные с подготовкой клеток, флуоресцентной визуализацией и количественной оценкой уровня перекиси водорода.

Протокол

1. Визуализация in vitro активных форм кислорода (АФК) культивируемых нейронов ганглиозных клеток сетчатки (РГК)

1. В день визуализации (обычно через 6-24 часа после нанесения клеток) проверьте ганглиозные клетки сетчатки под микроскопом, чтобы подтвердить рост аксонов РГК.
2. Для визуализации живых клеток перенесите покровные стекла из чашки для культивирования в камеру для визуализации живых клеток.
3. Настройте микроскоп для визуализации. Используйте инвертированный микроскоп с дифференциально-интерференционным контрастным объективом (DIC), длинночастотным красным фильтром OG590 и камерой EM-CCD.
4. Перед визуализацией замените среду для культивирования клеток рыбок данио с сывороткой и антибиотиками (ZFCM) (+)) на среду для культивирования клеток рыбок данио без сыворотки и антибиотиков (ZFCM(-)).
5. После того, как ячейки будут расположены с 10-кратным объективом, получите изображения с 60-кратным увеличением с помощью объектива с высоким уровнем погружения в масло NA. Используйте дополнительное 1,5-кратное увеличение.
6. Во-первых, получите изображения DIC. Затем создайте изображение roGFP2-Orp1 с помощью соответствующего набора фильтров. Возбуждайте roGFP2-Orp1 с помощью фильтров возбуждения 405/20 и 480/30 нм последовательно и получайте изображения с помощью эмиссионного фильтра 535/30 нм после того, как свет прошел через дихроичное зеркало 505DCXR.
7. После получения первого набора изображений замените носители на носители, содержащие различные лечебные растворы. Среду следует менять каждые 30 минут визуализации, чтобы избежать изменений pH и осмолярности.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
35-мм чашка для культивирования	Сарштедт	83-3900
Покровное стекло	Корнинг	2850-22
Одноразовые чашки Петри (100 x 15 мм)	ВВР	25384-094 (Английский)
Фетальная бычья сыворотка	ThermoFisher Scientific	26140087
Инвертированный микроскоп	Компания Nikon	ТЭ2000
Ламинин	ThermoFisher Scientific	No 23017-015
Leibovitz's L-15 Medium с феноловым красным	Gibco/Fisher Scientific	Тел.: 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium без фенола красного	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027 (Английский
Пенициллин/стрептомицин	ThermoFisher Scientific	15140122
Фенол красный	Сигма Алдич	П0290
Поли-D-лизин (PDL)	Сигма Алдич	П7280
Фильтр Steritop 0,22 мкм	Многородность	S2GPT05RE
Дигидрат хлорида кальция	Научный центр Фишера	С79-500
глюкоза	Сигма Олдрич	Г7528
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Н4034

гг. )