Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующей экспертизой по этике животных.
1. Предварительная подготовка (необязательно: подготовка за 1 день)
- Приготовьте три вида раствора искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) (Нормальный, Сахарозный и Восстановительный растворы, по 1 л каждый; см. табл. 1). Отрегулируйте осмоляльность растворов до 300 ± 10 мОм и охладите сахарозу ACSF до температуры, близкой к замерзанию (0-4 °C).
заметка: Использование режущего раствора с низким содержанием натрия (ACSF-Sucrose) помогает сохранить жизнеспособность нейронов в поверхностных слоях острых срезов.
- Приготовьте 0,75 мл раствора пластыря, содержащего красный флуорофор (например, Alexa-594) и зеленый синтетический индикатор кальция (например, Oregon Green BAPTA-1; см. Таблицу 1). Включите биоцитин (см. Таблицу 1) в раствор пластыря, если требуется апостериорная морфологическая идентификация зарегистрированных клеток.
- Отрегулируйте осмоляльность раствора до 280 ± 5 мОм и pH до 7,35 ± 0,5. Постоянно храните раствор в холодильнике или на льду.
заметка: Выбор показателя кальция должен основываться на его динамическом диапазоне и на характере исследуемых событийCa2+.
- С помощью съемника микропипеток подготовить патч-пипетки из капилляров из боросиликатного стекла (см. Таблицу материалов) с наконечником ≈ 2 мкм (сопротивление пипетки 3-5 МОм) и стимулирующие пипетки из боросиликатных тетастеклянных капилляров (см. Таблицу материалов) с наконечником 2-5 мкм.
заметка: Настройки съемника для изготовления пипеток заданного диаметра и формы будут определяться типом нити накала и результатами испытаний на рампу для данного типа стекла.
2. Запись патч-клэмпа целыми клетками
- Установите срез гиппокампа на место в ванне, расположенной под объективом (увеличение: 40x, числовая апертура: 0,8) лазерного сканирующего двухфотонного микроскопа. Постоянно продавливайте ванну оксигенированным ACSF-Normal, нагретым до 30-32 °C со скоростью 2,5-3 мл/мин.
- Используйте инфракрасный дифференциальный интерференционный контраст (IR-DIC) или микроскопию Додта-SGC для определения местоположения интересующей клетки по ее размеру, форме и положению.
заметка: В зависимости от целевой популяции нейронов, трансгенная мышиная модель может быть использована для легкого обнаружения интересующих клеток. В этом случае этот этап можно заменить с использованием флуоресцентного источника света.
- Заполните дозатор для стимуляции раствором ACSF-Normal, содержащим красный флуорофор (например, Alexa-594).
- Установите пипетку для стимуляции (подключенную к блоку для электростимуляции) в верхней части среза так, чтобы наконечник находился в той же области, что и интересующая ячейка.
- Наполнив патч-пипетку раствором и прикрепив ее к ножнице, установите ее над срезом так, чтобы его кончик находился прямо над интересующей клеткой.
- Вставьте шприц в трехпозиционный запорный кран и подключите его к патч-пипетке через пластиковую трубку. Введите постоянное положительное давление в патч-пипетку (≈ 0,1 мл) с помощью шприца. Держите запорный кран в положении «близко».
- Активируйте программный модуль управления усилителем и переключитесь в режим напряжения-зажима, нажав на кнопку "VC". Откройте программное обеспечение для сбора электрофизиологических данных (например, clampex) для регистрации электрофизиологических сигналов и нажмите на значок «Тест мембраны», чтобы оно непрерывно отправляло импульс квадратного напряжения (5 мВ, 10 мс), который необходим для мониторинга изменений сопротивления пипетки.
- Опустите дозатор пластыря так, чтобы он оказался прямо над целевой клеткой. При контакте с клеточной мембраной снимите давление, повернув запорный кран в положение «открыто><».
заметка: Контакт с клеточной мембраной обнаруживается, когда наблюдается небольшое увеличение сопротивления пипетки (≈ 0,2 МОм), а небольшое углубление на клетке вызвано положительным давлением.
- С помощью пустого шприца, вставленного в запорный кран, подавайте небольшое отрицательное давление на патч-пипетку, пока сопротивление пипетки, обеспечиваемое программным обеспечением, не достигнет 1 ГОм. В окне «Тест мембраны» программного обеспечения для сбора данных зажмите ячейку на -60 мВ.
- Продолжайте оказывать отрицательное давление до тех пор, пока ячейка не будет открыта и не будет достигнута конфигурация всей ячейки. Определение этого состояния клетки основано на резком изменении сопротивления пипетки (от 1 ГОм до 70-500 МОм в зависимости от типа интернейрона) и появлении больших емкостных переходных процессов в окне «Мембранный тест».
3. Двухфотонный кальций (Ca2+)Визуализация
- Если вас интересуют возбуждающие постсинаптические реакции, добавьте блокатор рецепторов ГАМК габазин (10 мкМ) и блокатор рецепторов ГАМАБ CGP55845 (2 мкМ) в ванну с ACSF.
- В программном модуле управления усилителем установите конфигурацию патча в положение ток-клещ, нажав на кнопку "CC", и запишите характер возбуждения ячейки в ответ на соматические инъекции деполяризующего тока (0,8-1,0 нА, 1 с). Подождите не менее 30 минут, пока ячейка заполнится индикаторами, присутствующими в растворе патча.
заметка: Характер возбуждения клетки и ее активные свойства могут быть использованы для идентификации ее подтипа, например, быстро спайковых клеток. Важно, чтобы концентрация индикатора стабилизировалась за счет диффузии до начала регистрации переходных процессов кальция (CaT) (см. Таблицу 2 для поиска и устранения неисправностей).
- Вызываемые AP CaT
- Используя программное обеспечение для получения изображений, начните получать изображения. Найдите интересующий вас дендрит с помощью красного флуоресцентного сигнала. Чтобы обеспечить видимый ответ, сначала выберите проксимальный дендрит (≤ 50 мкм), так как эффективность обратного распространения AP может значительно снижаться с расстоянием в ГАМКергических интернейронах.
- С помощью инструмента «прямоугольник» в программном обеспечении для получения изображений увеличьте целевую область и переключитесь в режим «xt» (линейное сканирование). Расположите скан поперек интересующей дендритной ветви. С помощью регуляторов интенсивности лазера в программном обеспечении для сбора данных установите двухфотонный лазер на минимальный уровень мощности, при котором базовая зеленая флуоресценция видна лишь слабо, чтобы избежать фототоксичности.
- В окне «Протокол» программы сбора электрофизиологических данных и программе получения изображений создайте запись нужной продолжительности, содержащую инжекцию соматического тока желаемой амплитуды.
- Используя программное обеспечение для получения изображений, нажмите кнопку «Начать запись» и непрерывно регистрируйте флуоресценцию в течение 1-2 с. Повторите получение изображения 3-10 раз. Подождите не менее 30 секунд между одиночными сканированиями, чтобы избежать фотоповреждений. Если вы получаете линейные сканы в нескольких точках вдоль дендрита, берите их случайным образом, чтобы избежать эффектов порядка.
- Синаптически вызванные CaT
- Найдите интересующий вас дендрит с помощью красного флуоресцентного сигнала.
- Установите дозатор для стимуляции на поверхность среза над интересующим дендритом. Медленно опустите дозатор для стимуляции на место, сводя к минимуму движения, чтобы не нарушить конфигурацию всей клетки. Расположите пипетку на расстоянии 10-15 мкм от дендрита.
- Чтобы визуализировать расположение синаптических микродоменов в аспинных дендритах, в программном обеспечении для получения изображений переключитесь в режим 'xt' (линейное сканирование) и расположите линию вдоль интересующей дендритной ветви.
- В окне «Протокол» (программного обеспечения для сбора данных по электрофизиологии) и программного обеспечения для получения изображений создайте запись исследования, которое запускает блок стимуляции после начала исследования.
- Используя программное обеспечение для сбора данных, нажмите кнопку "Начать запись", чтобы непрерывно сканировать дендрит в течение 1-2 с. Повторите сбор данных 3-5 раз, ожидая 30 секунд между сканированиями, чтобы предотвратить фотоповреждение.
заметка: Продолжительность сканирования может быть скорректирована в зависимости от кинетики вызванного события, но должна быть сведена к минимуму для предотвращения фотоповреждений (см. Таблицу 2 для поиска и устранения неисправностей).
- Повторите шаг 3.4.5 в различных условиях (например, при разной интенсивности/продолжительности стимуляции, введении фармакологического блокатора и т.д.) в зависимости от конкретного рассматриваемого вопроса.
- Прекратите сбор данных, когда в клетке появятся признаки ухудшения здоровья: деполяризация ниже -45 мВ, повышение исходного уровняCa2+, морфологическое ухудшение состояния дендритов (например, блеббинг, фрагментация; см. Таблицу 2 для поиска и устранения неисправностей).
- Чтобы получить предварительную информацию о морфологии клетки и вести учет расположения стимуляционной пипетки, приобретите Z-стек клетки в красном канале. Используя программное обеспечение для сбора данных в режиме xyz, установите верхний и нижний пределы стека, чтобы получить изображение всей ячейки со всеми включенными процессами. Установите «размер шага» на 1 мкм и инициируйте сбор стека с помощью кнопки «Начать запись».
- Когда получение Z-стека будет завершено, используйте опцию «Максимальная проекция» в программном обеспечении, чтобы наложить все фокусные планы стека и проверить качество получения. Затем медленно втяните патч-пипетку из среза.
- Чтобы зафиксировать срез для апостериорной морфологической идентификации, быстро выньте срез из ванны с помощью плоской кисти и поместите его между двумя фильтровальными листами в чашке Петри, заполненной ACSF. Замените ACSF 4% раствором параформальдегида (PFA) и оставьте посуду в комнате или холодильнике с температурой 4 °C на ночь.
Таблица 1: Рецепты решений. Соединения и концентрации растворов, используемых во время протокола.
| решение | компонент | Концентрация (мМ) |
| ACSF-Нормальный | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 |
| НаН2ПО4 | 1.25 |
| MgSO4 | 2 |
| NaHCO3 | 26 |
| глюкоза | 10 |
| CaCl2 | 2 |
| ACSF-Recovery | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 |
| НаН2ПО4 | 1.25 |
| MgSO4 | 3 |
| NaHCO3 | 26 |
| глюкоза | 10 |
| CaCl2 | 1 |
| ACSF-Sucrose | KCl | 2 |
| НаН2ПО4 | 1.25 |
| MgSO4 | 7 |
| NaHCO3 | 26 |
| глюкоза | 10 |
| сахароза | 219 |
| CaCl2 | 1 |
| K+-based Patch-решение | К+-глюконат | 130 |
| ХЕПЕС | 10 |
| MgCl2 | 2 |
| Фосфокреатин ди(трис)соль | 10 |
| АТФ-Трис | 2 |
| ГТП-Трис | 0,2 |
| Биоцитин | 72 |
| Алекса-594 | 0,02 |
| Орегон Грин-BAPTA-1 | 0,2 |
Таблица 2: Таблица устранения неполадок. Решения распространенных проблем, которые могут возникнуть во время эксперимента с визуализацией Ca2+.
| проблема | решение |
| Не удается подключить здоровый нейрон | Проверьте наличие признаков того, что срезы нездоровы: сморщенные или опухшие клетки, видимые ядра и т.д. Если это так, выбросьте ломтики. Также проверьте стойкость патч-пипетки и осмоляльность раствора пластыря; Замените их, если значения не находятся в соответствующем диапазоне. |
| Сигнал флуоресценции от дендритов низкий | Подождите, пока ячейка заполнится. Если препятствие препятствует диффундации раствора пластыря в клетку, попробуйте приложить небольшое отрицательное давление к пипетке. |
| Электрическая стимуляция не вызывает реакцию Ca2+ | Проверьте наличие артефакта в электрофизиологической записи. Если отсутствует, проверьте неисправность блока короткого замыкания/стимуляции. Если она присутствует, увеличьте интенсивность стимуляции или переместите пипетку для стимуляции ближе к дендриту. Следует отметить, что расстояние между стимулирующим электродом и дендритом не должно превышать 8 мкм, чтобы предотвратить прямую деполяризацию дендритов при изучении синаптических реакций. |
| Вызванный сигнал Ca2+ слишком высок/насыщает индикатор Ca2+ | Уменьшите мощность лазера. Если проблема сохраняется в нескольких ячейках, используйте другой индикатор Ca2+ с более низким сродством Ca2+. |
| Базовый сигнал Ca2+ постепенно увеличивается в ходе эксперимента | Подождите больше времени между отдельными сканированиями. Если базовый уровень все еще увеличивается, прекратите сбор данных; Это указывает на то, что здоровье клетки, вероятно, ухудшается. |
| Амплитуда сигнала Ca2+ уменьшается во время сканирования | Уменьшите мощность лазера или уменьшите масштаб (если применимо). |
| Дендрит фрагментируется («блеббинг») после сканирования | Уменьшите мощность лазера или уменьшите масштаб. Если блеббинг ограничен целевым дендритом, выберите другой дендрит и уменьшите мощность лазера/уменьшение масштаба. Если несколько дендритов блебируют, остановите захват. |
| Флуоресцентные сигналы «дрейфуют» за пределы линии сканирования после развертки | Уменьшите движение в срезе за счет снижения скорости перфузии ACSF. Перед установкой исправления убедитесь, что срез надежно закреплен на месте сеткой. |
