Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Сборка пипетки для записи и впрыска
- Потяните стеклянный капилляр длиной около 7 см (внешний диаметр 1 мм) с помощью съемника для дозатора.
- Разломайте кончик капилляра и проверьте отверстие под световым микроскопом. Убедитесь, что внутренний диаметр составляет от 30 мкм до 40 мкм.
- Вставьте серебряную проволоку длиной 7 см в стеклянный капилляр с примерно 1 см, выступающей из неконического конца стеклянной пипетки.
- Согните лишнюю нить перпендикулярно стеклянному капилляру.
- Нанесите каплю гибкого пластичного клея на стержень иглы для подкожных инъекций 30 G.
- Введите иглу для подкожных инъекций 30 G в стеклянную пипетку в соответствии со схемами, представленными на рисунке 1.
- Добавьте второй слой клея, чтобы обеспечить надлежащую герметизацию от места соединения между стеклянной пипеткой и иглой для подкожных инъекций.
- Дайте пипетке высохнуть кончиком вверх примерно на 12 часов, чтобы обеспечить надлежащее отверждение клея. Готовый результат показан на рисунке 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в острых экспериментах, и стерилизация наконечника пипетки не требуется.
2. Подготовка животных
- Поместите крысу в бокс для анестезии.
- Вызвать анестезию с помощью 4% изофлурана в течение 5-10 минут.
- Поместите животное на стереотаксический стол с грелкой и ректальным зондом для поддержания температуры тела 37 °C. Используйте носовой конус с 2% изофлураном для поддержания анестезии. Закрепите голову крысы с помощью ушных упоров и держателя для зубов.
- Нанесите офтальмологическую мазь или глазные капли, в том числе 1% капли атропина, чтобы помочь расширению зрачка. Чтобы предотвратить сухость, наносите смазывающие капли примерно каждые 30 минут.
- Побрейте голову и очистите ее 10% повидон-йодом.
- Для местной анестезии введите 0,5 мл 2% лидокаина под волосистую часть головы в 2-3 местах путем поднятия кожи и введения кончика иглы.
- Подтвердите достаточный уровень анестезии, выполнив щипление пальца ноги и наблюдая за отсутствием движения. Кроме того, необходимо контролировать частоту сердечных сокращений, чтобы убедиться, что она находится в пределах нормы (от 300 до 400 уд/мин).
- Надрежьте кожу головы по прямой линии вдоль срединной линии лезвием скальпеля #10, чтобы обнажить как корональные, так и сагиттальные швы.
- Обнажите точки Лямбда и Брегма, отодвинув хирургическим шпателем ткань, покрывающую череп.
- Выровняйте черепную коробку так, чтобы положения Брегмы и Лямбды находились в одной плоскости.
- Чтобы установить точку отсчета, используйте стереотаксическое устройство с установленной стеклянной трубкой, чтобы установить его прямо над Bregma. Это будет «ноль» для переднезадних и медиально-латеральных координат измерения.
- Установите точку интереса, переместив стереотаксическую монтировку в нужные координаты, запишите стереотаксические координаты и нарисуйте квадрат вокруг целевой области, который отметит место, где будет выполняться трепанация черепа.
- Используйте хирургическую бормашину со стерилизованной бормашиной вдоль отмеченного квадрата медленно, без давления, чтобы удалить костный материал. Будьте осторожны и не сверлите слишком долго в одной и той же области, так как это приведет к выделению тепла и образованию повреждений коры головного мозга.
- Когда кость, разделяющая трепанацию черепа, стала достаточно тонкой, осторожно удалите черепной срез пинцетом, чтобы обнажить кору.
- Часто орошайте обнаженную кору головного мозга искусственной спинномозговой жидкостью, чтобы предотвратить высыхание тканей.
заметка: Удаление твердой мозговой оболочки не является необходимым для крысы, так как кончик инжектора достаточно прочен для проникновения.
3. Заполнение и монтаж системы впрыска
- Наполните микрошприц объемом 5-10 мкл путем аспирации с минеральным маслом.
- Заполните иглу для подкожных инъекций неподвижной стеклянной пипеткой раствором 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) и 300 мкМ γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) или раствором 2% лидокаина с 0,5% CSB 9. Разбавьте все растворы физиологическим раствором.
- В случае обильного вещества наполните с помощью обычного шприца и используйте обычные профилактические приемы, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
- В случае более дорогих веществ минеральное масло может быть использовано для заполнения инжектора, а затем химическое вещество может быть введено путем аспирации. Разница в плотности между минеральным маслом и водой относительно велика, поэтому это вещество является хорошим кандидатом для введения водных растворов><.
заметка: Для подтверждения разделения между обеими жидкостями может быть добавлен краситель.
- Чтобы наполнить инъекционную пипетку, необходимо аспирировать раствором шприц объемом 1 мл и медленно ввести его в пипетку.
- Обратите особое внимание на утечки в областях, указанных на рисунке 1, промокнув эти участки начисто и наблюдая за утечками, медленно вводя раствор с помощью шприца.
- Извлеките шприц объемом 1 мл. При этом поддерживайте легкое давление на поршень, чтобы вакуум не удалял раствор из инъекционной пипетки.
- Аспирируйте микрошприц с минеральным маслом и плотно приложите его к заполненной пипетке для инъекций. Затем тщательно сотрите излишки раствора с собранного инжектора марлей.
- Введите очень маленький объем, достаточный для того, чтобы на кончике стеклянной пипетки образовалась небольшая капля, чтобы убедиться, что наконечник не заблокирован
.
- Установите инжектор на систему микронасоса и убедитесь, что он хорошо закреплен.
- Осторожно расположите наконечник инжектора в целевых координатах и опустите наконечник к поверхности коры.
- Медленно опускайте инжектор с помощью стереотаксического аппарата к целевой структуре (верхнему холмику) с использованием соответствующих анатомических координат.
- Накройте обнаженную кору теплым агаром, чтобы предотвратить высыхание тканей.
4. Инъекция и обратимая инактивация
- Установите микроинжекторный насос на впрыск от 400 до 800 нл со скоростью 40 нл/мин и нажмите Run для начала впрыска. Обратите внимание, что скорость скачков будет снижаться во время инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальной установке нейронная активность восстанавливалась в течение часа после окончания доставки ГАМК. Любое откалиброванное механическое устройство может быть использовано для подачи давления на шприц для микроинъекций и проведения инъекции.
- После получения электрофизиологических данных следует усыпить с использованием метода, одобренного местным Сообществом по этике животных.
