Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Приготовление растворов
- Приготовьте 500 мл стандартной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), содержащей компоненты, описанные в нашей опубликованной работе, как указано в таблице 1.
- Используйте чистые стеклянные стаканы с деионизированной водой для приготовления свежего раствора ACSF. Промойте шпатели деионизированной водой и высушите перед использованием, чтобы добавить хлорид натрия (NaCl), хлорид калия (KCl), дигидрофосфат натрия (2PO4), бикарбонат натрия (NaHCO3), сульфат магния (MgSO4), D-глюкозу и добавьте хлорид кальция (CaCl2) после пузырькового раствора с 95%O2 / 5% CO2смесь в течение ~20 мин (как подробно описано в таблице 1) до 500 мл деионизированной воды. Перемешайте до полного растворения.
- Убедитесь, что ACSF полностью прозрачный без каких-либо осадков. Затем отрегулируйте pH до 7,2-7,4. Пузырь с газовой смесью, состоящей из 95%О2 и 5%СО2 в течение ~20 мин.
- Приготовьте 250 мл раствора для резки срезов, содержащего химические вещества, описанные в таблице 2.
- Добавьте KCl, хлорид магния (MgCl2),2PO4, NaHCO3, холин·Cl и D-глюкозу и добавьте хлорид кальция (CaCl2) в последнюю очередь, как указано в 1.1.1, в 250 мл деионизированной воды и растворите, как описано в пунктах 1.1.1 и 1.1.2.
- После барботирования с 95% O2/5% CO2 поместите раствор в морозильную камеру на 15-20 минут, чтобы режущий раствор стал ледяным и частично ><замерзшим.
заметка: Этот режущий раствор мы используем при изготовлении срезов от 1-2-месячных мышей; Формула может отличаться для мышей старше 2 месяцев.
- Приготовьте раствор липополисахарида (ЛПС), растворив его в стерильном изотоническом растворе, не содержащем эндотоксинов (0,9% NaCl). ЛПС вводят внутрибрюшинно (0,5 мг/кг) и начинают регистрировать через 2 ч.
2. Подготовка среза префронтальной коры головного мозга
- Достаньте раствор для резки из морозилки и гомогенизируйте до получения слякоти. Поместите раствор на лед и постоянно пузыритесь с 95% O,2/5% CO2.
- С помощью больших острых ножниц быстро обезглавьте мышь, как описано, и немедленно положите голову в стакан, наполненный ледяным (0-4°C) раствором для резки.
- Разрежьте верхнюю часть черепа по средней линии в каудальном направлении к носу тонкими ножницами и удалите боковые части черепа. Извлеките мозг тонким шпателем и опустите в ледяной раствор для резки. <бр/>
заметка: Шаги 2.2-2.3 должны быть выполнены быстро (в идеале < 1 мин).
- Поместите мозг на крышку 9-сантиметровой чашки Петри, наполненной льдом. Промойте мозг ледяным раствором для резки. Срежьте мозжечок и обонятельную луковицу лезвием бритвы.
- Нанесите цианоакрилатный клей на держатель образца вибратома. Аккуратно поместите мозговой блок на каплю клея ростральной стороной вверх и сразу же погрузите в ледяной раствор для резки.
- Отрегулируйте держатель лезвия вибратома под углом 15° относительно горизонтальной плоскости и подготовьте 350-мкм корональные срезы мозга (частота колебаний лопасти = 85 Гц, скорость = 0,1 мм/с).
- С помощью пипетки перенесите срезы в камеру восстановления, заполненную ACSF, инкубируйте в течение 1 ч (при RT) с постоянным барботированием 95%O2/5% CO2.
3. Запись патчей для всей клетки
- Изготовьте стеклянные боросиликатные микропипетки для использования в качестве записывающих электродов или слоеных микропипеток в соответствии с конкретными рекомендациями в руководстве по эксплуатации пуллера. Для регистрирующих электродов сопротивление наконечника находится в диапазоне 4-6 МОм, в то время как для объемных микропипеток диаметр наконечника находится в диапазоне 2-5 мкм.
- Добавьте к ACSF блокатор Na+ каналов (Тетродотоксин (TTX), 1 мкМ) для блокировки быстрого Na+ канала и, следовательно, потенциалов действия, и поддерживайте постоянную скорость потока этого раствора на уровне 2-3 мл/мин в камере регистрации путем перистальтической накачки в камеру и аспирации из нее. Постоянно пузырите ACSF с 95%O2/5%CO2, чтобы обеспечить жизнеспособность ломтиков.
- Перенесите срез мозга в записывающую камеру с помощью модифицированной пастеровской пипетки, тонкий кончик которой был обрезан в соответствии с размером среза. Накройте срез платиновым анкером для слайсов с параллельными нейлоновыми нитями, расположенными на расстоянии ≥2 мм друг от друга, чтобы удержать срез на платформе.
- Заполните записывающую микропипетку внутренним раствором (Таблица 3) и заполните объемные микропипетки гамма-аминомасляной кислотой (ГАМК) в концентрациях 10 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ (растворенной в ACSF) или ACSF в качестве управления транспортным средством.
- Чтобы предотвратить засорение мусором, приложите легкое положительное давление с помощью шприца объемом 1 мл перед погружением записывающего электрода в ACSF. С помощью микроманипулятора под микроскопом (объектив с 4-кратным увеличением) расположите записывающий электрод и затяжку микропипеткой так, чтобы наконечники оказались в центре видеоизображения на мониторе (рис. 1A).
- Отрегулируйте фокусировку микроскопа (объектив с 40-кратным увеличением), постепенно опуская пуховую микропипетку, и поместите ее над регистрирующим нейроном под углом 45°. Сохраняйте записанное расстояние между кончиком слоеной микропипетки и нейроном в пределах 20-40 мкм (рис. 1B). Медленно и осторожно подойдите к нейрону с помощью записывающего электрода, а затем отпустите положительное давление. Нанесите слабое и кратковременное всасывание через трубку, соединенную с держателем электрода, чтобы создать гигаомное уплотнение.
- Поддерживайте напряжение на уровне 0 мВ. После формирования гигаомного уплотнения компенсируйте быструю и медленную емкость вручную или автоматически. Затем примените короткое и сильное отсасывание через упомянутую выше трубку, чтобы перейти в режим цельных ячеек.
- Запись eIPSC в режиме напряжения-зажима. Подайте низкое давление газа (азот, 4–6 фунтов на квадратный дюйм) в микропипетку с помощью Picospritzer, управляемого ступенчатым генератором напряжения Master 8, для подачи одиночных или парных затяжек ГАМК (Рисунок 2).
Таблица 1. Запись ACSF.
Сталь
См.
г.
Сталь
См.
См.
Сталь
| вещество | г/моль | Концентрация (мМ) | Вес (г/л) |
| NaCl | 58 .443 | 119 | 6.9547 |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| 2PO4 | 137,99 | 1 | 0,1380 |
| НаОГС3 | 84.007 Материал 84.007 | 26,2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0,1565 |
| D-глюкоза | 198,17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110.98 | 2.5 | 0,2775 |
Таблица 2. Раствор для нарезки ломтиков.
Проч.
Сталь
Сталь
См.
Сталь
| вещество | г/моль | Концентрация (мМ) | Вес (г/л) |
| KCl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0.6665 |
| 2PO4 | 137,99 | 1.25 | 0,1725 |
| НаОГС3 | 84.007 Материал 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Холин·Cl | 139,63 | 115 | 16.0575 |
| D-глюкоза | 198,17 | 7 | 1,3872 |
| CaCl2 | 110.98 | 0,5 | 0,0555 |
Таблица 3. Внутреннее решение для записи патчей по всей ячейке.
Сталь
)
Сталь
Кабель
Проч.
Сталь
Тариф
См.
См.
| вещество | г/моль | Концентрация (мМ) | Вес (г/л) |
| Cs глюконат | 328.052 | 100 | 32.8052 (Английский |
| CsCl | 168,36 | 5 | 0.8418 |
| ХЕПЕС | 238.301 | 10 | 2,3830 |
| MgCl2 | 95.211 | 2 | 0,1904 |
| CaCl2 | 110.98 | 1 | 0,1110 |
| БАПТА | 476.433 | 11 | 5.2408 |
| Na2АТФ | 551,1 | 4 | 2.2044 |
| Na2GTP | 523.2 | 0,4 | 0,2093 |
