$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Внешние и внутренние решения
- Используйте раствор Рингера у млекопитающих во время диссекции сетчатки и в качестве наружного раствора при последующей электрофизиологической регистрации. Приготовьте раствор Рингера у млекопитающих из 10-кратного исходного раствора (без кальция) в день регистрации и добавляйте CaCl2по каплям после 15 минут карбогенации (95%O2 и 5%CO2). Конечный 1х раствор содержит (в мМ): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,12PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 и 10 D-глюкозу.
- Используйте два внутренних решения для определения характеристик колебаний SAC. Проверьте полезность приготовленных растворов при длительной записи целоклеточного патч-клетка на ганглиозных клетках сетчатки (РГК) взрослых мышей и храните проверенные партии в аликвотах объемом 500 мкл при -20 °C до использования.
- Для регистрации колебаний мембранного потенциала используют внутренний раствор на основе калия, который содержит (в мМ): 125 K-глюконат, 8 NaCl, 4 аденозинтрифосфат (АТФ)-Mg, 0,5 ли-гуанозинтрифосфат (ГТФ), 5 этиленгликоль тетрауксусную кислоту (EGTA), 10 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновую кислоту (HEPES) и 0,2% биоцитин (w/v). Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью KOH.
- Для регистрации возбуждающих и тормозящих постсинаптических токов используют внутренний раствор на основе цезия, который содержит (в мМ): 100 Cs-метансульфонат, 8 NaCl, 4 АТФ-Mg, 0,5 Li-ГТФ, 5 EGTA, 10 HEPES и 0,2% биоцитина (w/v). Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью CsOH.
2. Подготовка ко дню записи
- Чтобы приготовить нитроцеллюлозную мембрану с открытыми отверстиями, вручную пробейте мембрану специальным перфоратором, изготовленным из затупленной иглы шприца 16 G, и расплющите мембрану между двумя чистыми стеклянными пластинами. Для сетчатки цельного крепления сделайте центральное отверстие диаметром 0,2 мм и окружите его 4 большими отверстиями диаметром 1-1,2 мм.
- Чтобы изготовить индивидуальную нить обратной засыпки для загрузки внутреннего раствора в электроды, расплавьте наконечник пипетки объемом 10 мкл в середине и аккуратно удлините расплавленную часть до тех пор, пока она не остынет и не затвердеет. Непосредственно перед использованием с помощью чистого бритвенного лезвия обрежьте нить до тех пор, пока она не станет немного длиннее патч-пипеток.
- Вытягивайте патч-пипетки в программируемом съемнике из боросиликатной стеклянной трубки с внутренней нитью. Изготовьте микропипетки в день эксперимента и используйте их немедленно.
заметка: Для регистрации САК мы используем следующую настройку пуллера: нагрев: 484; тяга: 0; скорость: 25; время задержки: 1; Давление: 400 и значение линейного изменения 462. Наружный диаметр (O.D.) и внутренний диаметр (I.D.) боросиликатных трубок составляют 1,65 мм и 1,0 мм соответственно. Сопротивление пипеток составляет 10-14 МОм.
- За час до забора тканей разморозьте пробирку с внутренним раствором, встряхивая ее на вихре в течение >30 минут.
3. Диссекция сетчатки
- Обезболивайте животное 4% изофлураном в кислороде до тех пор, пока животное не потеряет реакцию на пощипывание пальца ноги. Принесите животное в жертву при вывихе шейного отдела.
- Отрежьте оба глазных яблока от зрительных нервов на расстоянии 1-2 мм от корешков зрительного нерва прямыми ножницами радужной оболочки.
- Покатайте глазные яблоки по чистому бумажному полотенцу, чтобы удалить кровь, а затем погрузите их в раствор Рингера для млекопитающих. Проделайте отверстие в лимбе иглой 23 G и рассеките глазные яблоки пополам, разрезав вдоль лимба микроножницами. Снимите роговицу и хрусталик с помощью тонких щипцов.
- Для цельного монтажа сетчатки аккуратно отклейте всю сетчатку от пигментированного эпителия тонкими щипцами и сделайте четыре ортогональных разреза 1,5-2 мм от края по направлению к диску зрительного нерва.
- Погрузите в чашку перфорированную нитроцеллюлозную мембрану и аккуратно проведите по ней сетчаткой ганглиозным клеточным слоем (GCL) вверх. Поместите головку зрительного нерва в центральное отверстие при подготовке сетчатки целиком. Переложите мембрану с сетчаткой в другую чистую посуду. Аккуратно разровняйте сетчатку тонкой кистью, чтобы она выглядела как мальтийский крест, и наложите все четыре края на отверстия.
- Если необходимо исследовать часть сетчатки за один раз, разрежьте каждый наглазник, приготовленный из Шага 3.3, на 3-4 части лезвием бритвы с прикрепленными остатками пигментированного эпителия. Неиспользованные детали защитите от света в карбогенированном наружном растворе и используйте в течение 12 часов.
- Промокните нитроцеллюлозную мембрану куском сухой фильтровальной бумаги и удалите стекловидное тело и внутреннюю пограничную мембрану с помощью щипцов и малярной кисти.
- Перед переносом сборки в записывающую камеру убедитесь, что все края сетчатки полностью прикреплены к мембране с помощью герметичного стекла в нижней части. Закрепите мембрану вакуумной смазкой на защитном стекле и увлажните сетчатку наружным раствором. Будьте осторожны, чтобы не задержать пузырьки воздуха под сборкой.
- Установите камеру на столик вертикального микроскопа. Перфузируйте камеру теплым (34-35 °С) карбогенированным наружным раствором со скоростью ~3 мл в минуту.
- Сначала исследуйте сетчатку под объективом с 10-кратным увеличением, а затем используйте 60-кратную линзу с водяным погружением, чтобы увидеть нейроны GCL и внутреннего ядерного слоя (INL) под дифференциальным интерференционным контрастом (DIC) и/или эпифлуоресценцией. Для визуализации САК, экспрессирующих tdTomato, используйте источник света на белом светодиоде (LED) в сочетании с фильтром возбуждения 554 нм и фильтром излучения 581 нм.
4. Запись патч-зажима для целых клеток с плоской сетчатки
- Отфильтруйте внутренний раствор через шприцевой фильтр в специальную нить обратной засыпки.
- Вставьте нить в только что вытянутую микропипетку и дозируйте внутренний раствор рядом с наконечником до тех пор, пока раствор не покроет серебряную электродную проволоку на >5 мм. Закрепите микропипетку на держателе электрода с помощью присоски, с помощью которой давление внутри электрода можно регулировать, нажимая или потягивая поршень подключенного к трубке пластикового шприца объемом 10 мл.
- Найдите пипетку под объективом и опустите ее на высоту ~100 мкм над сетчаткой. В режиме следящего тока (I = 0) используйте смещение постоянного тока для обнуления постоянного сигнала напряжения. Измерьте сопротивление пипетки в режиме токового зажима (IClamp), вводя прямоугольные токи с фиксированной амплитудой через пипетку, когда она находится в ванне, и нейтрализуйте разницу, поворачивая ручку Raccess. Используйте показания ручки Raccess для расчета сопротивления пипетки по закону Ома.
- Медленно подведите электрод на высоту ~10 мкм над сетчаткой. Приложите положительное давление к электроду. Наблюдайте за изменением отражения вблизи наконечника пипетки по мере его приближения к сетчатке. Быстро, но осторожно вдавите пипетку в GCL и немедленно уменьшите положительное давление.
- Переместите пипетку к помеченному нейрону. Избегайте контакта с другими нейронами, кровеносными сосудами и концевыми частями клеток Мюллера. При необходимости приложите больше положительного давления, чтобы предотвратить засорение электродов.
- Расположите кончик пипетки рядом со средней линией помеченного нейрона до тех пор, пока не станет видна ямочка. Сбросьте положительное давление и дайте плазматической мембране отскочить обратно на наконечник пипетки.
- Подайте на пипетку отрицательный ток от 20 до 120 пА, чтобы помочь образованию гигаомного уплотнения. При необходимости примените мягкую аспирацию, чтобы втянуть плазматическую мембрану в пипетку. Подождите 5 минут после формирования уплотнения, чтобы разорвать клеточную мембрану. Это позволяет очистить пролитый внутренний раствор путем суперплавления. Разорвите мембрану путем легкого отсасывания.
- После разрыва мембраны и находясь в режиме текущего зажима, включите баланс моста и отрегулируйте его с помощью ручки Raccess.
заметка: Для такой маленькой ячейки, как SAC, требуется лишь небольшая регулировка, если таковая имеется. В качестве альтернативы можно регистрировать возбуждающие и тормозящие постсинаптические токи в режиме зажима напряжения (VClamp), удерживая ячейку с обратными потенциалами хлорида (около -75 мВ) и глутамата (около 0 мВ) соответственно. Проверьте и отрегулируйте положение пипетки, если это необходимо, чтобы компенсировать случайный дрейф сетчатки и/или микроманипулятора.
- Для регистрации изменения мембранного потенциала или тока до, во время и после фармакологического лечения готовят синаптические блокаторы (например, цианквиксалин [CNQX], (2R)-амино-5-фосфонопентаноат [AP5], пикротоксин, тубокурарин и т.д.) и модуляторы каналов (например, флупиртин, допамин, меклофенамовую кислоту и т.д.) свежими в день эксперимента из замороженных запасов. Разведите препараты карбогенированным раствором Рингера. Наносите их периодическим способом через перфузию.
- После записи аккуратно извлеките пипетку из сомы. Переложите сборку из камеры в чистую посуду. Отсоедините и снова прикрепите сетчатку к другой сплющенной нитроцеллюлозной мембране без пробитых отверстий, чтобы обеспечить плоскостность сетчатки во время фиксации.