Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Монтаж срезов ткани спинного мозга на МЭА
- Прогрейте стерильную питательную среду в инкубаторе (37 °С, слегка приоткрыв крышку для насыщения кислородом).
- Поместите многоэлектродную решетку или МЭА с помощью стерильного пинцета с резиновыми наконечниками при комнатной температуре (RT) в чашке Петри под стереомикроскопом так, чтобы электродная решетка была в фокусе. Центрируйте каплю куриной плазмы объемом 6 мкл на чистой, беспыльной и стерильной электродной решетке. С помощью небольшого шпателя осторожно проведите два участка спинного мозга вентральными сторонами друг к другу в каплю плазмы. Не прикасайтесь шпателем к электродам.
- Добавьте 8 мкл тромбина вокруг куриной плазменной капли. С помощью наконечника для тромбиновой пипетки тщательно перемешайте и распределите смесь куриной плазмы и тромбина вокруг двух ломтиков. Опять же, не прикасайтесь к хрупкой электродной решетке напрямую. Непосредственно перед коагуляцией аспирируйте избыток куриной плазмы/тромбина.
- Закройте чашку Петри крышкой, чтобы сохранить высокую влажность, в то время как сборка MEA/культура находится около 1 часа в увлажненной камере внутри инкубатора при температуре 37 °C.
- Осторожно добавьте 10 мкл питательной среды в камеру для культивирования, закройте чашку Петри крышкой и снова поставьте в инкубатор примерно на 30 минут.
- Поместите каждую сборку MEA/культуру со стерильными, покрытыми резиной наконечниками в роликовую трубку, добавьте 3 мл питательной среды и плотно закройте крышку. Поместите роликовую трубку в роликовый барабан, вращающийся со скоростью 1 - 2 об/мин в инкубаторе в атмосфере, содержащей 5%CO2 при температуре 37 °C.
- Меняйте половину питательной среды через 7 дней in vitro (DIV) и после 1 - 2 раза в неделю.
2. Механические повреждения
- Извлеките сборку MEA/culture со стерильными, покрытыми резиной наконечниками из роликовой трубки и поместите в чашку Петри без питательной среды под стереомикроскопом с фокусом на ткани. Визуально убедитесь, что два среза сплавлены.
- Удерживайте узел MEA/культура неподвижно, поместив пинцет с наконечниками с резиновым покрытием на MEA.
- Поместите лезвие скальпеля в канавку MEA рядом с срезами ткани. Держите скальпель достаточно горизонтально.
- Поднимите рукоятку скальпеля вверх, но оставьте лезвие скальпеля в канавке MEA таким образом, чтобы лезвие «скатывалось» от основания к кончику и тем самым разрезало ткань, покрывающую канавку.
- При необходимости устраните любые остаточные тканевые соединения кончиком иглы 25 G. Работайте только в области внутри канавки и не касайтесь нежных краев.
- Поместите узел MEA/культура обратно в роликовую трубу. Обеспечьте культуры 3 мл свежей питательной среды и поместите их обратно в барабан в инкубаторе.
3. Электрофизиологические записи спонтанной активности
- Чтобы исследовать функциональную регенерацию между двумя срезами спинного мозга после выбранного числа DIV, установите сборку MEA/культуру в записывающую камеру на микроскопе и нанесите около 500 мкл внеклеточного раствора (см. список материалов).
- Подождите 10 минут перед первой записью, чтобы система стабилизировалась.
- Запишите основную спонтанную активность 2 раза в течение примерно 10 минут с каждого электрода, детектирующего активность MEA в режиме RT.
- Чтобы обеспечить стабильные внеклеточные условия, обменивайте внеклеточный раствор после каждого сеанса записи.
- Чтобы расторможить сетку, нанесите внеклеточный раствор, содержащий стрихнин (1 мкМ) и габазин (10 мкМ). Подождите не менее 2 минут, прежде чем начать запись.
4. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения внеклеточных зарегистрированных потенциалов действия, используйте детектор, основанный на стандартных отклонениях, и последующий дискриминатор для каждого электрода.
- Отобразите обнаруженную нейронную активность каждого электрода на растровом графике в соответствии со стандартными процедурами (рис. 1F).
- Определите и отобразите общую сетевую активность для каждого среза путем суммирования количества событий в соответствующих каналах в пределах скользящего окна в 10 мс, смещенного на 1 мс (рис. 1G).
- Обнаруживайте в каждом срезе отдельные всплески (кластеры активности, которые появляются на нескольких электродах). Поэтому установите минимальный порог пиковой активности в соответствующей общей сетевой активности и определите начало и конец каждого всплеска. Например, подходящим пороговым значением является 25% от средней амплитуды всплеска, и начало пакета может быть определено как первое событие во временном окне продолжительностью не менее 5 мс, а окончание пакета - как последнее событие во временном окне продолжительностью не менее 25 мс.
- Чтобы количественно оценить функциональную регенерацию, рассчитайте процент синхронизированных пакетов между двумя срезами. Для этого вычислите задержку между пакетом в одном срезе и следующим всплеском в другом.
заметка: Пара пакетов называется «синхронизированной», когда задержка меньше средней длины пакета. Особенно в культурах с высокой активностью существует вероятность того, что обе стороны случайно инициируют всплеск в выбранном окне задержки. Этот факт необходимо учитывать при количественной оценке процента синхронизированных пакетов.
