Внешнее возбуждение одномерных структурированных нейронных культур

Аннотация

Источник:Stern, S., et al. Внешнее возбуждение нейронов с использованием электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культурах. J. vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует технику стимуляции культур нейронов с линейным рисунком однородным однонаправленным электрическим полем.

Протокол

1. Визуализация спонтанной или вызванной активности в культурах нейронов с помощью флуоресцентных красителей.

1. Приготовьте раствор 50 мкг чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя (см. Таблицу материалов/реагентов) в 50 мкл ДМСО (диметилсульфоксида).
2. Приготовьте внеклеточный записывающий раствор (ЭМ), содержащий (в мМ) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-глюкозу, 45 сахарозу (pH 7,4).
3. Инкубируйте культуру нейронов в 2 мл EM с 8 мкл раствора чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя в течение 1 ч. Защищайте от света и осторожно вращайте, чтобы обеспечить равномерное распределение красителя по клеткам.
4. Замените раствор свежим ЭМ перед визуализацией. Флуоресцентная визуализация показана на рисунке 1.
5. Изображение на флуоресцентном микроскопе с оптическими фильтрами для флуоресцентной визуализации кальция (пик возбуждения на 488 нм, пик излучения на 520 нм) с использованием камеры и программного обеспечения, способного количественно оценить интенсивность любой области интереса (ROI) в поле зрения микроскопа.

2. Электрическая стимуляция культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая настройка для электростимуляции показана на рисунке 2. Покровная пластинка, на которой культура нейронов выращивалась около 14 дней, помещается в чашку Петри под флуоресцентным микроскопом. Электрическая активность нейронов визуализируется с помощью чувствительных к кальцию красителей, в то время как напряжение подается через две пары электродов, расположенных вне культуры. Электроды приводятся в движение генератором сигналов, выход которого усиливается двухканальным усилителем. Регулирование напряжения для стимуляции предпочтительнее более стандартного управления током, поскольку векторы электрического поля определяются напрямую, что позволяет легко складывать и комбинировать векторы. Для этого требуется тщательная проверка однородности электрического поля, которая может быть выполнена по всему образцу в случае регулирования напряжения. При использовании управления напряжением следует следить за тем, чтобы не было контуров заземления, и следует проверять однородность электрического поля.

1. Для электростимуляции однородным электрическим полем используют пару параллельных электродных проводов.
   1. Используйте электроды из платины толщиной порядка 0,005 дюйма (127 мкм). При использовании с покровными стеклами 13 мм убедитесь, что расстояние между двумя электродами составляет около 11 мм, и расположите электроды на расстоянии 1 мм над культурой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для изготовления электрододержателя (Рисунок 3A) используйте политетрафторэтилен (ПТФЭ). Просверлите узкие отверстия в ПТФЭ для вставки электродов. Устройство должно быть выше внеклеточного раствора, чтобы верхний конец, где обнажены электроды, никогда не соприкасался с раствором. Для изоляции используйте эпоксидный клей на любой части электродных выводов, которая может быть открыта.
   2. Используйте квадратную форму импульса с рабочим циклом 50%, без компонента постоянного тока для предотвращения электролиза. Изменяйте длительность импульса в диапазоне от 10 μс до 4 мс, чтобы обеспечить эффективную стимуляцию без сжигания культуры. Убедитесь, что амплитуда находится в диапазоне ± 22 В (см. рисунок 3). Квадратный импульс можно наблюдать на осциллографе, подключенном параллельно электродам.
      заметка: Для простого программирования любой желаемой формы сигнала используйте коммерческое программное обеспечение для редактирования осциллограмм (см. список материалов). Введите в графическом виде желаемую осциллограмму и отправьте ее в генератор осциллограмм.
2. Для проверки однородности поля используйте зондовый электрод. Используйте сетку размером не менее 1 мм x 1 мм, чтобы можно было перемещать щуп в области между электродами и измерять электрический потенциал.
   1. Измерьте электрический потенциал. Используйте для вычисления электрического поля. Используйте один из электродов в качестве электрода сравнения. Измерьте электрическое поле с различной длительностью импульса от 100 μс до 4 мс (см. Рисунок 3B для примера длительности импульса 100 μс), чтобы убедиться в однородности поля в диапазоне длительностей стимуляции><. заметка: На рисунке 3D приведен пример измеренной однородности электрического поля при длительности импульса 1 мс.

Результаты

Рисунок 1: Примеры следов кальциевых переходных процессов, полученных во время синхронных сетевых всплесков. А. Изображение нейронов, которые были окрашены до эксперимента кальциевым красителем. В. Кривые зависимости интенсивности от времени ROI в точке А, где цвет кривой представляет цвет границы окупаемости инвестиций в точке А. Значительное увеличение интенсивности, синхронизирова...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлористый кальций , 1М	Флюка	No 21098	Решение для внеклеточной записи.
D-(+)-глюкоза, 1М	Сигма-Олдрич	Номер 65146	Гальваническая среда, раствор для внеклеточной записи.
Хепес, 1М	Сигма-Олдрич	Н0887	Решение для внеклеточной записи.
KCl, 3М	Мерк	1049361000	Решение для внеклеточной записи.
Магния хлорид , 1М	Сигма-Олдрич	М1028	Решение для внеклеточной записи.
NaCl, 4М	Био-лаборатория	19030591	Решение для внеклеточной записи.
Сахароза, 1М	Сигма-Олдрич	С1888	Решение для внеклеточной записи.
Электродные провода	A-M Systems, Карлсборг, штат Вашингтон	767000	Электростимуляция культур нейронов.
Генератор сигналов	BKПрессия	4079	Формирование электрического сигнала.
усилитель	самодельный		Усиление напряжения сигнала от генератора сигналов к электродам.
электропитание	матрица	МПС-3005 ЛК-3	Электропитание распылительной машины.
Платиновая проволока толщиной 0,005 дюйма; A-M Systems,	Карлсборг WA	767000	Электростимуляция культур нейронов.