Стимуляция структурированных нейронных культур магнитным полем

Аннотация

Источник: Stern, S., et al., Внешнее возбуждение нейронов с использованием электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культурах. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует метод стимуляции нейронных культур, выращенных в узорчатом круглом кольце на покровном листе, с использованием изменяющегося во времени магнитного поля.

Протокол

1. Подготовка покровных листов для 1D культур.

1. Очистите покровные стекла путем погружения в базовый раствор пираньи, состоящий из 75 мл DDW, 25 мл 25% раствора аммиака и 25 мл 30% перекиси водорода. Поместите раствор со стеклянными покровными стеклами на нагревательную пластину при температуре ~ 50°C на 30 минут, а затем высушите стеклянные покровные стекла азотом.
2. Сначала покровные стекла покрываются тонкой хромированной пленкой (99,999%) толщиной 6 Å, а затем слоем золота 30 Å (99,999%) с использованием осаждения из паровой фазы или распыления.
   1. Для достижения скорости распыления 0,05 – 1 Å/с используйте распылительную машину с 2 электронными лучами и вакуумную систему со скоростью 260 л/с с целевыми размерами 2 дюйма и 4 дюйма. Используйте поворотный каскад, который может работать от 0 до 100 выстрелов в минуту (RPM). Используйте мощность распыления постоянного тока (DC) от 0 до 750 Вт.
   2. Чтобы получить плазму при давлении 10 мТорр в камере, вращайте устройство со скоростью 30 об/мин и используйте аргон на 99,999%.
   3. Работайте с источником питания пистолетов-распылителей при мощности напыления постоянного тока 40 Вт для хрома, что приводит к коэффициенту покрытия ~ 0,12 Å/с, и при мощности распыления постоянного тока 10 Вт для золота, что приводит к ~ 0,28 Å/с.
3. С помощью ультразвука в течение 30 мин растворите 0,1 г 1-октадекантиола в 100 мл этанола ABS AR. Поместите покровные стекла с покрытием Cr-Au в этот раствор на 2 часа, затем постирайте этанолом ABS AR и высушите азотом.
4. Приготовьте раствор из 100 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (D-PBS) и 3,5 г трехблочного сополимера (см. Таблицу материалов/реактивов) путем перемешивания в течение 1 - 2 ч при 600 - 700 об/мин. Поместите покровные стекла в раствор на 1 час. Сухие покровные стекла с азотом.
5. Механически протравите нужный рисунок, поцарапав слой биоотбраковки. Делают это с помощью перьевого плоттера, где перо заменяется офортной иглой. Процарапайте узор через металлические слои, чтобы добраться до нижнего стекла. Управляйте этим процессом с помощью компьютера для достижения воспроизводимого желаемого шаблона. Паттерны, образованные этим процессом, показаны на рисунках 1 и 2.
6. Приготовьте биосовместимый слой из 100 мл d-PBS, 3,5 г триблочного сополимера, 35,7 мкл/мл фибронектина и 29 мкл/мл ламинина.
   1. Стерилизуйте покровные стекла под ультрафиолетовым светом не менее 10 мин. Инкубируйте покровные стекла в приготовленном биосовместимом растворе в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биосовместимый слой образуется только там, где слой биоотторжения был вытравлен на предыдущем этапе.
   2. На следующий день постирайте покровные стекла два раза с помощью P-DBS. Инкубируйте их в PM на ночь. Теперь покровные стекла готовы к нанесению покрытия ячеек.

2. Поддержание нейронных культур.

1. Приготовьте сменную среду (КМ) в составе (на мл): 0,9 мл MEM+3G, 0,1 мл HHI HS, 10 мкл 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUDR) с уридином 100x.
2. Приготовьте конечную среду (ЧМ) в составе (на мл): 0,9 мл MEM+3G и 0,1 мл HI HS.
3. Замените ПМ на 1-1,5 мл СМ через 4 дня in vitro (DIV). При 6 DIV замените 50% CM на свежий CM. В DIV 8 измените среду на 1,5 мл FM, а затем меняйте 50% FM каждые 2 дня. Примерно через неделю возникает спонтанная синхронная активность.

3. Визуализация спонтанной или вызванной активности в культурах нейронов с помощью флуоресцентных красителей.

1. Приготовьте раствор 50 мкг кальций-чувствительного флуоресцентного красителя (см. Таблицу материалов/реагентов) в 50 мкл ДМСО (диметилсульфоксида).
2. Приготовьте внеклеточный записывающий раствор (ЭМ), содержащий (в мМ) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-глюкозу, 45 сахарозу (pH 7,4).
3. Инкубируйте культуру нейронов в 2 мл EM с 8 мкл раствора чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя в течение 1 ч. Защищайте от света и осторожно вращайте, чтобы обеспечить равномерное распределение красителя по клеткам.
4. Замените раствор свежим ЭМ перед визуализацией. Флуоресцентная визуализация показана на рисунке 3.
5. Изображение на флуоресцентном микроскопе с оптическими фильтрами для флуоресцентной визуализации кальция (пик возбуждения на 488 нм, пик излучения на 520 нм) с использованием камеры и программного обеспечения, способного количественно оценить интенсивность любой области интереса (ROI) в поле зрения микроскопа.

4. Магнитная стимуляция культур

Примечание: Базовая настройка для магнитной стимуляции показана на рисунке 1. В правом верхнем углу показан инвертированный флуоресцентный микроскоп, который используется для визуализации чувствительных к кальцию красителей в нейронах. Магнитная катушка (синие круги) расположена примерно на 5 мм концентрически над культурой нейронного кольца (синий контур). Катушка звукоснимателя (красный круг) по окружности чашки Петри контролирует напряжение, индуцированное магнитным импульсом. В левом верхнем углу показана измеренная динамика катушки магнитного стимулятора (МС) с напряжением конденсатора 5 000 кВ, интегрированной от катушки звукоснимателя. Индуцированное электрическое поле (рассчитанное для радиуса кольца 14 мм) отображается зеленым цветом, а магнитное поле — синим. Внизу представлены изображения культуры нейронов. В левом нижнем углу представлено яркое изображение узорчатого 24-миллиметрового покровного стекла. Белые участки – это нейроны. Фотографируемый узор состоит из концентрических кольцевых культур с разными радиусами. В правом нижнем углу находится увеличенный короткий сегмент колец, показывающий отдельные нейроны. Для масштаба ширина колец составляет около 200 мкм.

1. Выращивайте нейроны в виде кругового кольца (вытравленного, как описано в пункте 1.5) для стимуляции 1D-культуры. Используйте чувствительный к кальцию флуоресцентный краситель для визуализации кальция (как описано в разделе 3) с 1D-культурой, созданной по тонким (170 мкм) длинным (10 мм) линиям.
   1. Используйте круглую магнитную катушку и расположите чашку Петри примерно на 5 мм ниже и концентрически с катушкой. Используйте специальную катушку диаметром около 30 мм (внутренний диаметр, внешний диаметр 46 мм) с индуктивностью L = 90 мГн, приводимую в движение самодельным или коммерческим ПС, нагруженным максимальным напряжением 5 кВ.
   2. Для магнитной стимуляции нейронных культур высоковольтное напряжение и ток разряжаются через проводящую катушку с помощью переключателя «высокий ток-высоковольтный». Магнитный стимулятор (МС) может быть построен с использованием больших конденсаторов, порядка 100 мФ, для получения высокого напряжения 1 - 5 кВ. В качестве альтернативы можно использовать коммерчески доступный МС (см. Таблицу материалов/Реагентов).
      заметка: Используйте прямоугольную медную проволоку толщиной 0,254 мм и шириной 6,35 мм с полиэфирным покрытием для изготовления самодельной катушки. Поверните провода на изготовленных на заказ рамах, изолированных стекловолокном и отлитых в эпоксидной смоле (см. Таблицу материалов/реагентов). В качестве альтернативы используйте имеющиеся в продаже катушки (см. Таблицу материалов/реагентов).

Результаты

Рисунок 1: Схема установки, используемой для магнитной стимуляции культур нейронов. Вверху показана магнитная катушка (синие кружки), которая расположена на 5 мм концентрически над культурой нейронального кольца, помещенной в чашку Петри (синий контур). Катушка звукоснимателя (красный круг), расположенная по окружности чашки Петри, измеряет напряжение, индуцированное магнитным импульсом. В нижней час...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CaCl2 , 1М	Флюка	No 21098	Решение для внеклеточной записи
D-(+)-глюкоза, 1М	Сигма-Олдрич	Номер 65146	Гальваническая среда, решение для внеклеточной записи
Д-ПБС	Сигма-Олдрич	Д8537	Клеточные культуры
Фибронектин	Сигма-Олдрич	Ф1141	Био покрытие
Флуо4, АМ	Технологии жизни	Ф14201	Визуализация спонтанной или вызванной активности
ФУДР	Сигма-Олдрич	Ф0503	Смена среды
Гентамицин	Сигма-Олдрич	Г1272	Гальваническая среда, Сменная среда, Конечная среда.
Хепес, 1М	Сигма-Олдрич	Н0887	Решение для внеклеточной записи
HI HS	дву	04-124-1А	Гальваническая среда, Сменная среда, Конечная среда
KCl, 3М	Мерк	1049361000	Решение для внеклеточной записи
Ламинин	Сигма-Олдрич	Л2020	Биопокрытие.
МЭМ х 1	Gibco	21090-022	Гальваническая среда, Сменная среда, Конечная среда
Магния хлорид , 1М	Сигма-Олдрич	М1028	Решение для внеклеточной записи
NaCl, 4М	Био-лаборатория	19030591	Решение для внеклеточной записи
Октадеканэтиол	Сигма-Олдрич	1858 г	Очистка покровных накладок с покрытием Cr-Au (1D культуры)
Сахароза, 1М	Сигма-Олдрич	С1888	Решение для внеклеточной записи
Уридин	Сигма-Олдрич	У3750	Смена среды
Распылительная машина	AJA International, Inc	УВД серии Орион-5	Покрытие стекла тонкими слоями металла
Перьевой плоттер	Хьюлетт Паккард	HP 7475A	Травление рисунка на покрытом покровном листе
электропитание	матрица	МПС-3005 ЛК-3	Электропитание распылительной машины
эпоксидный	Когнис	Версамид 140	Литье самодельных катушек
эпоксидный	оболочка	ЭПОН 815	Литье самодельных катушек

гг. .