Использование многоэлектродных матриц для измерения синаптической физиологии в сферах 3D-кокультуры

Аннотация

Источник: Cvetkovic, C., et al. Моделирование синаптических микросхем с 3D-сокультурами астроцитов и нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует процедуру использования многоэлектродной матрицы (MEA) для измерения синаптической физиологии в сферах 3D-кокультуры. Этот метод позволяет понять динамику нейронной сети и активность синаптических сетевых всплесков в 3D-сферах.

Протокол

Измерение живой синаптической физиологии с помощью многоэлектродных матриц (MEA)

1. Подготовьте MEA для культивирования клеток.

1. Очистите поверхность каждого MEA 1 мл моющего средства в течение 1 ч. Промойте стерильной деионизированной (DI) водой, промойте 70% этанолом для стерилизации, а затем высушите на воздухе в шкафу для биобезопасности под ультрафиолетовым свет><ом. заметка: MEA можно хранить в деионизированной воде при температуре 4 °C в стерильных условиях до использования.
2. Приготовьте 0,5 мг/мл раствора полиорнитина (PLO), растворив 50 мг PLO в 100 мл буфера борной кислоты. Покройте поверхность каждого MEA 1 мл PLO, чтобы сделать его гидрофильным, и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 4 часов. Снимите PLO и промойте поверхность деионизионной водой.
3. Разбавьте раствор покрытия внеклеточного матрикса (ECM) базальной средой (DMEM/F12) для получения исходного раствора в дозе 1 мг/мл. Для получения рабочего раствора ресуспендируйте 3 мл заготовки ECM в 33 мл предварительно охлажденной среды DMEM/F12, доведя общий объем до 36 мл при концентрации 80 мкг/мл.
4. Добавьте 1 мл рабочего раствора ECM в каждый MEA и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 4 часов.
5. Снимите ЭБУ и поместите сферы в среду объемом 1,5 мл на поверхность MEA, убедившись, что сферы расположены на верхней части электродной решетки (рис. 1A, 1A'). Дайте носителю прилипнуть в течение 2 дней. Меняйте половину среды каждые 2–3 дня (или чаще, если это необходимо), следя за тем, чтобы сферы не были нарушены.
   заметка: Добавление факторов роста может улучшить приживаемость и созревание культуры.

2. Измерьте электрическую активность нейронных сфер.

1. Установите систему многоэлектродной матрицы (MEA) с верхней панелью с регулируемой температурой. Создайте программу с фильтром высоких частот 5 Гц, фильтром нижних частот 200 Гц и пороговым значением 5x стандартного отклонения (SD).
2. Поместите MEA на сцену и зарегистрируйте спонтанную электрическую активность (рис. 1B, B'). Сохраняйте необработанные данные, включая частоту и амплитуду спайков, для статистического анализа.
   заметка: Перфузионная система может быть использована с MEA для добавления фармакологических агентов или для увеличения потока свежих сред для длительной регистрации. При желании может быть выполнена дополнительная постобработка шипов.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативная живая синаптическая физиология нейронных сфер на многоэлектродных массивах (MEA). (А, А') MEA используются для измерения живой синаптической физиологии нейронных сфер. Сферы iNeurons (A) или кокультуры iNeurons и hAstros (A') могут быть культивированы на поверхностях MEA с субстратами, имитирующими ECM (см. шаг 4.1). (В, В') Растровые граф...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM/F12	Термофишер	10565-042 (Английский)	С добавкой GlutaMAX
Анти/анти	Термофишер	15240062
В27	Термофишер	17504044	Приложение к СМИ
Гепарин	сигма	Х3149-50КУ	Рабочая концентрация: 2 мг/мл
Мембранная матрица Matrigel	Корнинг	354230 (Английский	Решение для нанесения покрытий ECM. Рабочая концентрация: 80 мкг/мл. Приготовьте на льду и убедитесь, что пипетки, пробирки и фильтрующий материал предварительно охлаждены.
Система MEA 2100	Многоканальные системы	MEA2100
N2	Термофишер	17502048	Приложение к СМИ
Поли-л-орнитин (PLO)	сигма	П3655-100МГ	Рабочая концентрация: 0,5 мг/мл