$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Абляция субпопуляции нейронов с помощью двухфотонного лазерного микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пользователи планируют выполнять визуализацию Ca после абляции, используйте линию UAShspzGCaMP6s. Если пользователи планируют проводить поведенческую запись после абляции, используйте линию UAS:EGFP, так как абляцию EGFP-положительных клеток выполнить проще, чем клеток, экспрессирующих GCaMP6s.
- Начните с настройки сопряжения линии Gal4, которая помечает конкретные нейроны, подлежащие изучению, и UAS:EGFP или UAShspzGCaMP6. Обязательно используйте перламутровый фон для обоих родителей, чтобы можно было получить перламутровые гомозиготы.
заметка: Гомозиготы перламутра не содержат меланофоров на поверхности тела (рис. 1В). В настоящем исследовании используется линия Gal4 gSAIzGFFM119B (которая обозначает pretectum) и другая линия Gal4 hspGFFDMC76A (которая обозначает ILH).
- На следующий день после начала спаривания соберите икру данио-рерио и поднимите ее до личиночной стадии, когда интересующие вас нейроны будут экспрессировать флуоресцентные репортеры.
- Посадите личинку данио-рерио в агарозу с низкой температурой плавления 2% (Рисунок 1B).
- Начните с приготовления 2% раствора агарозного бульона: растворите 2 г порошка агарозы с низкой температурой плавления в 100 мл воды системы (т.е. в воде, используемой для содержания взрослых рыбок данио в системе циркуляции воды) или воде E3, нагрев воду до точки кипения в микроволновой печи и энергично перемешав.
- Разогрейте в микроволновой печи агарозный бульон с низкой температурой плавления 2%, пока он не закипит. Вылейте 3,5-4,0 мл агарозы на крышку 6-сантиметровой чашки Петри. Подождите, пока агароза остынет, чтобы она была теплой на ощупь, прежде чем продолжить.
- Затем поместите одну личинку (не обезболенную на этом этапе) в агарозу. Продолжайте регулировать положение и ориентацию личинки так, чтобы она находилась вертикально, с помощью иглы для препарирования (рисунок 1C), пока агароза не затвердеет, чтобы обеспечить правильное положение личинки.
заметка: Личинка будет продолжать плавать, пока агароза затвердевает.
- Как только личинка будет размещена, подождите 5 минут, чтобы агароза полностью застыла.
- Залейте агарозу 5 мл раствора трикаина (0,4% при 1x рабочей концентрации).
заметка: Чтобы избежать движений личинок во время лазерной абляции, личинки должны находиться под наркозом на протяжении всей процедуры абляции.
- Абляцию личинки с помощью функции обесцвечивания в системе двухфотонной лазерной микроскопии.
- Поместите внедренную в агарозу личинку под двухфотонный лазерный сканирующий микроскоп и запустите систему микроскопии.
- Запустите программное обеспечение для получения изображений и нажмите кнопку «Вкл.» на вкладке «Лазер», чтобы включить лазер (Рисунок 1D). Подождите, пока «Статус» лазера изменится с «Занят» на «Режим заблокирован».
- На вкладке «Каналы» установите длину волны лазера на 880 нм (максимальная мощность: примерно 2 300 мВт) для абляции EGFP или на 800 нм (максимальная мощность: примерно 2 600 мВт) для абляции GCaMP.
- Выберите объектив с 20-кратным увеличением, вручную перемещая объектив револьвера. Перейдите на вкладку «Найти», нажмите «GFP», чтобы изменить оптические пути, и просмотрите флуоресценцию непосредственно на глаз.
- Найдите мозг личинки данио-рерио в центре поля зрения, затем нажмите на вкладку «Получение», чтобы вернуться к двухфотонной микроскопии.
- В качестве записи состояния «до абляции» сделайте z-стековое изображение с объективом 20X с высокой скоростью сканирования (чтобы избежать теплового повреждения). Позже сравните изображения, сделанные до и после экспериментов по абляции (рис. 2A). Чтобы получить z-стек, нажмите «Z-Stack», чтобы выбрать опцию z-stack и развернуть вкладку. Установите нижний предел (нажмите кнопку «Установить первым») после фокусировки на вентральном конце мозга личинки, и установите верхний предел (нажмите кнопку «Установить последним») после фокусировки на самой дорсальной поверхности мозга. Затем нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы запустить получение изображения z-stack.
- Выберите объектив с 63-кратным увеличением, вручную переместив объектив револьвера.
- Нажмите на вкладку «Найти», чтобы переключиться на эпифлуоресцентную микроскопию, найдите клетки, которые должны быть удалены, в центре зрения на глаз, затем нажмите на вкладку «Получение», чтобы вернуться к лазерной сканирующей микроскопии.
- На вкладке «Режим съемки» установите «Размер кадра» на 256 x 256. Нажмите «Live» и понаблюдайте за интересующими нейронами.
- Начиная с самой дорсальной стороны, найдите фокальную плоскость, в которой клетки, подлежащие абляции, находятся в фокусе.
- Отметьте небольшую круглую область диаметром около одной трети размера клетки на каждом нейроне в качестве области интереса (ROI) с помощью функции «Регионы».
- Установите скорость сканирования на 13,93 с/256 x 256 пикселей (134,42 мкм x 134,42 мкм), что соответствует времени задержки лазера примерно 200 мкс/пиксель или 200 мкс/0,5 мкм. Также установите 4 повторения («Цикл итерации: 4»). В качестве альтернативы можно оптимизировать количество итераций и скорость сканирования таким образом, чтобы была достигнута достаточная абляция.
- Выполните функцию «Отбеливание» для абляции в сочетании с функцией «Временной ряд (2 цикла)» для отображения образца (до и после абляции) и «Регионы» (для установки ROI) или аналогичными функциями в используемом программном обеспечении (Рисунок 1D).
- Сравнивая первое изображение (до абляции) и второе изображение (после абляции) в цикле временных рядов, убедитесь, что после обесцвечивания флуоресценция в целевых клетках снижается до уровня, наблюдаемого на фоновом уровне (рис. 2B).
- Если флуоресценция все еще присутствует после абляции, увеличьте количество итераций.
- Затем переместите фокальную плоскость немного вглубь (т.е. в сторону вентральной стороны) и выберите следующую фокальную плоскость, где появляются неабляционные клетки.
- Выполните функцию отбеливания, как описано выше (шаг 1.9). Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будут удалены все клетки в интересующей нервной структуре.
- Пройдя по всем фокальным плоскостям, охватывающим нервные структуры, подлежащие абляции, проверьте клетки на наличие отмененной флуоресценции. Если обнаруживается, что некоторые клетки все еще флуоресцентны из-за недостаточной абляции, облучите их лазером снова, как описано выше.
- Если личинку необходимо извлечь из агарозы после лазерного облучения, не пытайтесь вытолкнуть ее из агарозы, так как это может повредить личинку. Вместо этого аккуратно сделайте крошечные надрезы в агарозе вокруг личинки перпендикулярно поверхности ее тела. Затем подождите, пока личинка выплывет из агарозы самостоятельно, когда действие анестетика закончится.
- Перейдите к следующей личинке для абляции или проведите контрольные эксперименты с использованием другой популяции нейронов, которые не участвуют в исследуемом поведении.
заметка: Здесь, в качестве контроля, нейроны обонятельных луковиц в UAS:EGFP; Личинки gSAIzGFFM119B были удалены лазером с использованием того же протокола, что и описано выше (Рисунок 2A, справа).
- Подождите несколько часов или 1 день для восстановления, прежде чем приступать к визуализации Ca (раздел 2) или поведенческой записи (раздел 3). В течение этого периода восстановления проверьте здоровье личинки (т.е. нормальное спонтанное плавание, отсутствие видимых тепловых повреждений вокруг удаленной области и т.д.) и удалите личинки, показывающие любые признаки плохого здоровья.
2. Визуализация кальция для регистрации активности нейронов, вызванной добычей, у личинок данио-рерио, абляционированных претектумом
- Чтобы подготовить записывающую камеру, наденьте на предметное стекло прокладку камеры гибридизации с надежным уплотнением так, чтобы клейкая сторона была обращена к стеклу, и снимите верхнюю защитную пленку><.
заметка: В результате получается небольшая записывающая камера диаметром 9 мм и глубиной 0,8 мм (рис. 3A).
- Затем поместите нейлоновую сетку (размер отверстия: 32 мкм) на трубку объемом 50 мл, нижняя часть которой открыта. Используйте колпачок, чтобы прикрепить сетку к трубке (рисунок 3B).
- Подготовьте парамецию (которая является добычей, которая будет использоваться в качестве визуального стимула для личинки).
заметка: Заранее подготовьте культуру Paramecium (шаги 2.3.1 и 2.3.2).
- Заранее приобретайте культуру семян парамеции из коммерческих источников или академических биоресурсных центров.
- Культивируйте парамеций в течение нескольких дней в воде, содержащей автоклавную рисовую солому и гранулу сухих пивных дрожжей (рисунок 3C).
- Пролейте культуру парамеция через 2 сита последовательно (одно с отверстием 150 мкм, затем другое с отверстием 75 мкм), чтобы удалить мусор из культуры.
- Соберите парамеции в проточный канал с предыдущего шага на нейлоновую сетку (апертура 13-мкм).
- Повторно подвесьте парамецию на нейлоновой сетке в стеклянный стакан с помощью отжимной бутылки с системной водой (Рисунок 3D).
- Промойте сетку (Рисунок 3B) в системной воде 2x (Рисунок 3E).
заметка: Целью данного этапа является удаление любых возможных пахучих и вкусовых веществ, содержащихся в питательной среде paramecium, поскольку целью настоящего исследования является наблюдение за визуально обусловленной активностью нейронов.
- Поместите личинку рыбки данио в раствор трикаина для обезболивания.
- Смонтируйте одну личинку в агарозе с низкой температурой плавления 2%.
- Сначала разогрейте в микроволновой печи агарозу с низкой температурой плавления 2% и добавьте в агарозу 1/10 объема 10-кратного концентрированного трикаина.
- Поместите одну каплю трикаинсодержащей агарозы на записывающую камеру (рисунок 3А).
- Убедившись, что агароза не слишком горячая, поместите обезболенную личинку (из шага 2.5) в агарозу, немедленно удалив излишки агарозы, чтобы поверхность агарозы выглядела слегка выпуклой.
- Быстро переведите личинку в вертикальное положение с помощью рассекающей иглы (рис. 1C).
заметка: Эти процедуры должны быть завершены в течение нескольких секунд до того, как агароза застынет.
- После того, как личинка будет правильно расположена, подождите 5 минут, чтобы агароза полностью застыла. Затем вылейте каплю 1x раствора трикаина на агарозу.
- Удалите агарозу вокруг головы личинки данио-рерио и освободите место для плавания парамеции с помощью хирургического ножа. Для этого сначала сделайте несколько небольших надрезов в агарозе (рисунок 3F). Затем осторожно удалите излишки агарозы, аккуратно вылив системную воду на камеру.
заметка: На этом этапе трикаин будет вымываться.
- Затем поместите один парамеций в камеру записи, чтобы он служил визуальным стимулом.
заметка: Когда парамеций плавает рядом с головой личинки рыбки данио, он вызывает нейронную реакцию (рисунок 3G).
- Поместите записывающую камеру под эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный научной CMOS-камерой (рис. 3H) и выберите объектив с 2,5-кратным увеличением (рис. 3I).
- Собирайте покадровые записи флуоресцентных сигналов GCaMP.
- Запустите приложение для получения изображений для установленной камеры.
- Нажмите «Панель последовательности» и выберите «Запись на жестком диске» на панели. В разделе "Настройки сканирования" установите "Количество кадров" на 900 или любое другое общее количество кадров по желанию.
заметка: Если возможно, используйте программное обеспечение для цейтраферной записи с модулем (в данном случае «Запись на жесткий диск»), который позволяет эффективно сохранять данные на жестком диске.
- На панели «Съемка» установите время экспозиции на 30 мс (т. е. 33,3 кадра в секунду) и Группирование 2 x 2.
- На управляющей сенсорной панели микроскопа выберите набор фильтров для GFP, так как GCaMP имеет спектры возбуждения/излучения, аналогичные GFP.
- Нажмите «Live» на панели «Захват», чтобы найти личинку в поле зрения камеры и сфокусироваться (рисунок 4A), а затем нажмите «Stop Live» и нажмите кнопку «Start». Сохраните фильм в формате .cxd или в любом другом формате, содержащем информацию об условиях съемки.
