$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Электрофизиология
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого протокола является получение записей токового зажима всей клетки от нейронов пирамидальных клеток уровня II/III, идентифицированных визуально по экспрессии GFP в мозге мыши, электропорированном GFP (или любом другом флуоресцентном белке, ранее подвергнутом электропорации). Используя этот протокол, можно изучить влияние генетической модификации, введенной ИУЭ, на электрические свойства нейрона. Приобретение специфических режимов возбуждения представляет собой постепенный процесс дифференцировки, который включает в себя динамическую экспрессию широкого репертуара ионных каналов и приводит к экспрессии переходных режимов возбуждения до поздних постнатальных стадий. Например, зрелые электрические реакции не наблюдаются в слоях II/III соматосенсорной коры мыши до P16.
- Предпосылки для проведения острых срезов
- Приготовьте 1 л ACSF с использованием высокочистой (дважды дистиллированной воды), содержащей 119 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO3, 11 мМ глюкозы, 2,5 мМ KCl, 1,2 мМ MgCl2, 2,5 мМ CaCl2 и 1 мМ2PO4. Титруйте pH до 7,3 - 7,4 с помощью HCl или NaOH. Отрегулируйте осмолярность до 290 мОсм.
- Пузырьковый ACSF с карбогеном (95% O2/5% CO2) в течение 15 - 20 мин с использованием тефлоновых трубок (~ 1 мм), для стабилизации pH до 7,3 - 7,4.
- Предпосылки для записи всей ячейки
- Убедитесь, что электрофизиологическая станция оснащена записывающей камерой, перфузионной системой, микроскопом, электродами (записывающими, стимулирующими и заземляющими), макро- и микроманипуляторами, жесткой виброустойчивой столешницей и клеткой Фарадея, стимулятором, усилителем и аналого-цифровым (АЦП) преобразователем, компьютером с программным обеспечением для сбора данных, а также фильтром GFP (или любым другим флуорохромом) для анализа генетически модифицированных нейронов (рис. 1А).
- Готовят внутриклеточный раствор, содержащий 115 мМ глюконата калия, 2 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 20 мМ KCl, 4 мМ Na2АТФ и 0,3 мМ Na3GTP, отрегулированный до pH 7,2 по KOH и до 290 мОм с помощью KCl.
- Делайте патч-пипетки, вытягивая капилляры из боросиликатного стекла. Подготовьте патч-электроды с помощью съемника микропипетки. Используйте боросиликатные капилляры (внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 0,86 мм, длина 10 см). Изготовьте патч-электроды с сопротивлением 3-10 МОм при заполнении внутриклеточным раствором.
- Перфузируйте записывающую камеру с помощью ACSF со скоростью 2 мл/мин. Поддерживайте температуру камеры на уровне около 33 °C.
- Запись всей клетки
- Перенесите срезы в камеру записи с помощью пастеровской пипетки (отрежьте длинный кончик) или небольшой кисточки. Зажмите ломтик арфой. Постоянно перфузируйте ломтики с помощью ACSF со скоростью 2 мл/мин.
- Заплатите GFP-положительный нейрон.
- Поместите срез в записывающую камеру и найдите интересующую область через микроскоп при малом увеличении (10X). Затем найдите GFP-положительную клетку для исправления с помощью цели 60x.
- Заполните записывающий электрод внутриклеточным раствором. С помощью шприца, подключенного к фильтру (фильтр 4 мм) и наконечника микрозагрузчика, заполните записывающий электрод внутриклеточным раствором.
- Поместите стеклянную пипетку в держатель для пипетки. Поместите наконечник пипетки в ванну и сосредоточьтесь на наконечнике. Как только пипетка окажется в ванне, подайте положительное давление через систему контроля обратного давления.
- Заплатите флуоресцентный нейрон (рисунок 1B).
- Подойдите к интересующей точке под визуальным контролем, сохраняя при этом противодавление в пипетке. При появлении небольшой ямочки на поверхности клетки сбросьте давление. На этом этапе может образоваться плотное уплотнение (сопротивление более 1 ГОм). В противном случае приложите легкое отрицательное давление (всасывание), чтобы облегчить его.
- Пока формируется уплотнение, доведите удерживающее напряжение зажима до -60 мВ. Как только уплотнение GΩ будет сформировано, подайте импульс всасывания, чтобы разорвать клеточную мембрану под пипеткой и перейти в режим полноклеточной обработки.
- Запишите действие, используя условия тока-зажима. Перейдя в режим работы со всей ячейкой, переключитесь с напряжения на режим токового клеща и начните запись. Например, чтобы зарегистрировать возбудимость ячейки, применяйте инжекции деполяризующего тока длительностью 500 мс (100 - 400 пА).
- Рассчитайте скорость срабатывания, построив график количество потенциалов действия вдоль цепи для увеличения входных токов.
заметка: По записям также могут быть рассчитаны мембранный потенциал покоя, входное сопротивление и емкость мембраны.
