Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Поросята и обращение с поросятами
- Используйте поросят мужского и женского пола систематическим и рандомизированным образом, чтобы исключить любые потенциальные искажающие факторы по половому признаку в соответствии с рекомендациями ARRIVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку период максимального роста мозга приходится на 3-5 дней после рождения поросенка, эксперименты проводятся исключительно с поросятами в возрасте 3-5 дней.
- Убедитесь, что поросята прибывают в виварий не менее чем за 24 часа до эксперимента, чтобы обеспечить адаптацию к окружающей среде.
заметка: Обученный ветеринарный персонал обеспечивает регулярный уход за животными. Поросята содержатся в клетках, температура которых поддерживается в индивидуальном порядке, под постоянным контролем и они получают полноценный заменитель молока в неограниченном количестве для предотвращения гипогликемии. Поросята также содержатся без заменителя молока (без учета норм) в течение как минимум 3 часов до анестезии и снабжаются одеялами и игрушками для обеспечения нормального уровня стимуляции. По возможности держите несколько поросят в одной клетке, чтобы обеспечить социализацию.
2. Разработка и настройка микроэлектродных матриц (MEA) для исследований нейротоксичности, вызванной анестезией (AIN) на модели поросенка
>ПРИМЕЧАНИЕ: В этой технологии используются МЭА на основе ферментов, которые предварительно покрыты ферментом и гальванизированы м-фенилендиаминдигидрохлоридом (мФД). Электроды были специально разработаны с жестким валом диаметром 40 мм и изготовлены для использования у поросят (Рисунок 1).
- Пожалуйста, ознакомьтесь с подробным описанием подготовки и калибровки MEA (Рисунок 2).
3. Анестезия и использование специального стереотаксического аппарата для поросенка
- Обезболивание животных с помощью анестезиологической рабочей станции с подходящим аппаратом искусственной вентиляции легких и устройствами для мониторинга, а также контроль физиологических параметров, таких как пульсоксиметрия, неинвазивное артериальное давление, электрокардиография и температура, на протяжении всего эксперимента, как описано ранее. Интубировать и проветривать поросят и вводить севофлурановую анестезию в 1 минимальной альвеолярной концентрации (ПДК) (примерно 2,5-3%) в течение 3,5 ч. Убедитесь, что на этих экспериментах присутствуют обученные сотрудники лаборатории. Шерсть, покрывающая область операции, удаляется с помощью электрических машинок для стрижки перед препарированием кожи.
заметка: Концентрация и продолжительность использования анестетика позволяют в эксперименте смоделировать продолжительность фактического воздействия анестезии во время хирургической процедуры. Кроме того, севофлуран является наиболее часто используемым общим анестетиком в педиатрической популяции, что делает исследование его безопасности чрезвычайно важным.
- Перед помещением в стереотаксическую раму начните нагрузку рокуронием в дозе 2,5 мг/кг и инфузию в дозе 1,5 мг/кг/ч, чтобы предотвратить движение животного во время фиксации в раме.
- Поместите поросенка в специальную стереотаксическую рамку, как только достаточная глубина анестезии будет подтверждена щипцом ноги.
- Обеспечьте достаточную набивку внутри стереотаксической рамы, поместив поросенка на прокладку с принудительным подогревом воздуха с дополнительной прокладкой (например, псевдоожиженным позиционером) для предотвращения пролежней.
- Поместите зубы верхней челюсти над зубчатым стержнем (рис. 3).
заметка: Зубной стержень должен находиться на достаточном уровне, чтобы очень прочно удерживать череп на месте.
- Зафиксируйте и затяните проникающие ушные планки в ушах, следя за тем, чтобы поросенок находился в положении средней линии. Расположите заостренные кончики боковых зацепов в ушном канале и вставьте ушные планки достаточно прочно, чтобы услышать звук «хлопок», связанный с проникновением в барабанную перепонку. Плотно прикрепите ушные планки к черепу и вставьте на одинаковую глубину с каждой стороны, чтобы предотвратить движение черепа во время эксперимента (Рисунок 4, Панель А).
заметка: Жизненно важно поддерживать поросенка в тепле (~37,8-38,6 °С) и непрерывно контролировать температуру в течение всей процедуры поддержания нормотермии. Это может быть достигнуто с помощью одеяла и/или тепловой лампы. Обязательно разместите тепловую лампу на соответствующем расстоянии, чтобы избежать ожога кожи животного.
- Сделайте разрез по средней линии длиной 4-6 см вдоль черепа, соблюдая осторожность, чтобы не поцарапать череп скальпелем. После того, как разрез будет сделан, используйте мягкое втягивание и тупое рассечение, чтобы приподнять кожу головы от черепа. Аккуратно потрите череп марлевой салфеткой, чтобы удалить любую соединительную ткань и обнажить линии швов (Рисунок 4, Панель Б).
заметка: Нет необходимости поддерживать стерильность во время экспериментов, не связанных с выживанием. Тем не менее, стерильность должна поддерживаться во время экспериментов по выживанию.
- Далее отразите волосистую часть головы, если это необходимо, чтобы обнажить интересующую область и определить предполагаемое место для трепанации черепа (Рисунок 5, Панель А). С помощью хирургического сверла создайте краниотомическое окно размером около 0,25см2 (может быть больше или меньше в зависимости от целей эксперимента) над исследуемой структурой, соблюдая осторожность, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку или нижележащую мозговую оболочку (рис. 5, панель B). С помощью тонких хирургических ножниц иссеките твердую мозговую оболочку, находящуюся над тканью мозга (Рисунок 5, Панель В).
- Расположите электрод как можно вертикальнее над брегмой, закрепив металлический рычаг сцены на микроманипуляторе стереотаксиса поросенка. Опустите электрод как можно ниже, не касаясь поверхности черепа. Запишите координаты брегмы (рис. 6, панель А).
- Определите передне-задние и медиально-латеральные координаты, а также глубину интересующей структуры по отношению к брегме. Определите стереотаксические координаты с помощью видового и возрастного стереотаксического атласа. В этом случае используйте стереотаксический атлас, разработанный специально для поросят.
- Переместите электрод так, чтобы он имел правильное передне-заднее и медиально-латеральное расположение, гарантируя, что микроэлектрод и аппарат расположены перпендикулярно поверхности. Поместите псевдоэлектрод сравнения под кожу головы, обеспечивая контакт с животным (Рисунок 6, Панель В).
- Медленно и осторожно опустите электрод на соответствующую глубину в мозг с помощью стереотаксической руки. Для последних 2 мм используйте гидравлический микропривод для дальнейшего привода электрода в точное место (Рисунок 6, Панель C).
заметка: Положение электродов должно находиться над окном краниотомии. Глубина электрода будет варьироваться в зависимости от интересующей структуры мозга. Нет необходимости закрывать разрез после завершения сбора данных в экспериментах, не связанных с выживанием.
4. Измерение внеклеточного глутамата под анестезией севофлураном
- Убедитесь, что поросенок находится под постоянным физиологическим наблюдением на протяжении всей процедуры. Поросята обезболивают ингаляционно (через лицевой конус) при подготовке к процедуре.
- После имплантации МЭА подождите 30 минут, чтобы электрод достиг исходного уровня, чтобы обеспечить правильное измерение в течение 3 часов (Рисунок 7).
- 0,25% бупивакаин (1 мл/кг) вводят подкожно в месте операции для купирования послеоперационной боли. Кроме того, бупренорфин с пролонгированным высвобождением вводится подкожно каждые 72 ч по мере необходимости.
