Подготовка модели крысы для оценки целостности визуальных путей с помощью электрофизиологической установки

Аннотация

Источник: Nguyen, C. T. et al., Одновременная запись электроретинографии и визуальных вызванных потенциалов у крыс под наркозом.J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует подготовку модели крысы к изучению здоровья сетчатки и целостности зрительного пути. К крысе подключают визуальный вызванный потенциал, электроретинографию и активные электроды, после чего выравнивают платформу с крысой перед чашей Ганцфельда для равномерного освещения сетчатки глаза и закрывают клетку Фарадея во избежание внешних помех.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Преимплантация электродов с хроническим визуальным вызванным потенциалом (VEP)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо собрать одновременные сигналы электроретинограммы (ЭРГ) и VEP, животным необходимо хирургически имплантировать электроды VEP по крайней мере за 1 неделю до сбора сигнала.

1. Перед экспериментом простерилизуйте операционный стол с помощью хлоргексидина (0,5% в 70% этанола). Автоклавируйте все хирургическое оборудование перед использованием. Накройте животное стерилизованной хирургической простыней. Убедитесь, что все экспериментаторы носят хирургические маски, халаты и стерилизованные перчатки.
2. Индуцируйте анестезию 3 - 3,5% изофлураном с О2 со скоростью потока 3 л/мин. Поддерживайте анестезию на уровне 1,5% и 2 л/мин на протяжении всей операции. Обеспечить достаточную глубину анестезии можно за счет отсутствия защемляющего рефлекса лапы.
3. Нанесите 1% карбоксиметилцеллюлозу натрия на роговицу для предотвращения сухости глаз.
4. Выбрейте участок размером 30 мм x 30 мм над лбом, сзади от глаз и спереди от ушей.
5. Поместите животное на грелку (37°C) для поддержания температуры тела и стабилизации головы животного с помощью стереотаксической рамы.
6. Продезинфицируйте выбритый участок 10% повидон-йодом три раза. Для области вокруг глаза следует избегать использования антисептиков на спиртовой основе, в соответствии со Стандартом практики, установленным Ассоциацией хирургических технологов.
7. Сделайте скальпелем срединно-сагиттальный разрез на голове и из этого вырезайте круг дермальной ткани диаметром ~20 мм, чтобы обнажить черепную кость.
8. Удалите подлежащую надкостницу путем соскабливания и высушивания марлей, чтобы обнажить корональные и сагиттальные черепные швы.
9. С помощью зубного бора, прикрепленного к бормашине, трепан проделайте два отверстия (диаметр 0,7 мм, глубина ~ 1 мм) в черепе на обоих полушариях по стереотаксическим координатам: 7 мм каудально к брегме, 3 мм латерально к средней линии.
10. Вкрутите винты из нержавеющей стали (диаметр 0,7 мм, длина 3 мм, стерилизованные хлоргексидином) в два предварительно изготовленных отверстия глубиной ~ 1 мм (2 мм открытого винта) для надежного крепления. Он контактирует с твердой мозговой оболочкой, не повреждая подлежащую кортикальную ткань.
11. Подготовьте операционную область для зубной амальгамы, высушив черепную кость марлей и втянув дряблую кожу двумя швами 3 - 0 в положении ~ 4 и 8 часов.
12. Нанесите стоматологическую амальгаму на открытый череп, чтобы закрепить винтовые электроды (винты из нержавеющей стали, описанные в шаге 1.10) на месте. Убедитесь, что ~ 1,5 мм винтов остаются открытыми для записи.
13. Снимите ретракционные швы.
14. Введите 0,5% карпрофена подкожно (5 мг/кг) для обезболивания и физиологический раствор (натрия хлорид 0,9%, 1,5 мл) подкожно для восполнения жидкости.
15. Позвольте животным восстановиться в отдельных клетках. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
16. Не возвращайте животное в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не оправится от операции (минимум 5 дней).
17. Продолжайте вводить 0,5% карпрофен подкожно для обезболивания (5 мг/кг) один раз в сутки в течение 4 дней.
18. Запишите ЭРГ и ВЭП через 1 неделю после операции.

2. Запись ERG и VEP

1. Подготовка сбора данных
   1. Используйте компьютерное программное обеспечение для одновременного запуска стимула и сбора данных в соответствии с настройками, рекомендованными ниже.
      1. Усиление сигналов (ERG: ×1,000, VEP: x10,000) с внутренним коэффициентом усиления, заданным изолированным предусилителем и усилителем, и с согласованием импеданса с обоими глазами.
      2. Установите частоту дискретизации для ERG на 4 кГц в течение окна записи 650 мс (2 560 точек), Для этого перейдите на вкладку «Временная база» в программном обеспечении для сбора данных (название и версию программного обеспечения см. в таблице для материалов), выберите «2 560» для образцов и «500 мс» для времени, которое вернет окно записи в 650 мс.
         1. Используйте тот же метод, чтобы установить частоту дискретизации для VEP на 10 кГц в течение эпохи 250 мс. Предоставьте 10 мсс исходного уровня перед стимулированием для записей ERG и VEP. Для этого перейдите на вкладку «Настройка»; выберите «Стимулятор», чтобы открыть новое диалоговое окно; в этом окне выберите "Пульс" из выпадающего списка для "Режим"; и установите значение для параметра "delay" на "10 мс".
      3. Установите полосовую фильтрацию ERG на 0,3 - 1 000 Гц (- 3 дБ). Это делается нажатием кнопки «Bio Amplifier» в программном обеспечении для сбора данных. Затем установите значение для "High Pass" на "0,3Hz", а значение для "low Pass" на "1 kHz".
      4. Используя вышеупомянутый метод, описанный в пункте 2.1.1.3, установите настройки полосы пропускания VEP на 0,1 - 100 Гц (- 3 дБ) в соответствии с рекомендациями Международного общества клинической электрофизиологии зрения (ISCEV) для регистрации VEP у человека.

2. Подготовка электродов

1. Изготовьте активные/неактивные электроды ERG и активные/неактивные электроды VEP, прикрепив серебряную проволоку или зажим типа «крокодил» к электроду соответственно. Коммерческое получение заземляющего электрода.
2. Для 4 электродов, изготовленных на заказ, отрежьте наружный конец от удлинителя электрода. Удалите 1 см внешнего изоляционного покрытия из политетрафторэтилена лезвием скальпеля, убедившись, что внутренний провод не поврежден.
3. Предварительно изготовьте неактивные электроды ERG, разрезав серебряную проволоку длиной 70 мм (толщина 0,3 мм) и сформировав петлю диаметром ~ 8 мм, чтобы окружить глаз крысы. Подготовьте равномерный круг, придав форму петли на кончике пипетки объемом 1 мл.
4. Предварительно оформите неактивные электроды VEP, вырезав серебро длиной 70 мм и сформировав эллипс ~ 8 мм в продольном диаметре, чтобы зацепить его за резцы крысы.
5. Предварительно сформируйте активные электроды ERG, отрезав серебряную проволоку длиной 30 мм и сформировав небольшую петлю для мягкого контакта с роговицей крысы (~ 1-2 мм в диаметре)
6. Надежно прикрепите электроды (2 активных ЭРГ, 2 неактивных ЭРГ, 1 неактивный VEP) к электродовому проводу, обвязав серебро с оголенным внутренним проводом.
7. Изолируйте излишки открытого металла малярной лентой, чтобы уменьшить фотоэлектрические артефакты.
8. На неактивных электродах ЭРГ приклейте небольшой кусочек застежки-липучки (~ 5 мм × 20 мм) к малярной ленте для обеспечения надежного крепления к шейному ремню грызуна.
9. Прикрепите зажим типа «крокодил» к внутреннему проводу электродных выводов, чтобы сделать электроды VEP активными.
10. Перед записью гальваническое покрытие открытых поверхностей серебряных проводов (т.е. неактивного кольца и активного наконечника) хлоридом с помощью источника постоянного тока 9 В в течение 20 секунд для улучшения проводимости сигнала.
    1. Для этого погрузите серебряный наконечник электродного провода ERG (действующего в качестве анода первичного элемента) в обычный физиологический раствор, а другой конец этого электродного провода подключите к положительной клемме 9-вольтовой батареи.
    2. Подсоедините другой провод (катод) к отрицательной клемме аккумулятора и также погрузите другой конец в солевой раствор. Отсоедините через 20 секунд и наблюдайте, чтобы серебряный наконечник электродного провода ERG равномерно покрылся белым цветом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Подготавливайте новые электроды ERG для каждого экспериментального сеанса (~ до 8 часов), чтобы обеспечить проходимость хлоридного покрытия.

3. Подготовка животных

1. Адаптируйте животных к темноте в течение ночи (≥ 8 часов) перед записью в светонепроницаемом помещении. Обеспечьте максимальную адаптацию к темноте, выключив свет в комнате и закрыв все двери и жалюзи. Сведите к минимуму утечку света, разместив светонепроницаемые материалы вокруг стыков дверей и окон и разместив экраны компьютеров за плотными черными шторами.
2. Проводите подготовку животных в темном помещении с помощью тусклого красного светодиода (LED; 17,4 кд.м-2, λ_max = 600 нм) для поддержания чувствительности стержня.
3. Обезболивайте крысу путем внутримышечного введения кетамина/ксилазина (60:5 мг/кг). Подтверждают достаточную глубину анестезии отсутствием лапячного рефлекса.
4. Для поддержания седативного эффекта при необходимости введите еще одну дозу анестезии (50% от начальной дозы) через 50 минут.
5. Для дополнительной местной анестезии нанесите по одной капле 0,5% проксиметакаина на каждый глаз и смахните лишнюю жидкость.
6. Для расширения зрачков нанесите по одной капле 0,5% тропикамида на каждый глаз, затем высушите лишнюю жидкость.

4. Позиционирование электродов ERG и VEP

1. Поместите животное на платформу ERG перед чашей Ганцфельда, расположенной в клетке Фарадея. Избегайте использования электрической грелки, так как она может внести электрический шум в электрофизиологические записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа прикреплена к циркуляционной платформе с подогревом воды для поддержания температуры тела.
2. Закрепите животное на платформе с помощью полоски застежки-липучки, плотно, но не плотно прилегающей к затылку.
3. Зацепите неактивный электрод VEP вокруг нижних резцов крысы, находящейся под наркозом.
4. Расположите неактивные электроды ЭРГ, неинвазивно обернув склеральное кольцо вокруг экватора глаза. Стабилизируйте это, прикрепив электроды к застежке-липучке вокруг затылка. Повторите то же самое для контралатерального глаза.
5. Закрепите активные электроды VEP, прикрепив зажимы типа «крокодил» к винтам из нержавеющей стали, предварительно имплантированным на череп.
6. Поместите небольшую каплю 1% карбоксиметилцеллюлозы натрия на роговицу перед установкой активного электрода ERG для улучшения качества сигнала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вискозная жидкость также помогает поддерживать гидратацию роговицы на протяжении всего эксперимента, чтобы свести к минимуму образование катаракты типа высыхания у грызунов.
7. Поместите небольшую каплю 1% карбоксиметилцеллюлозы натрия на нижние резцы, чтобы улучшить контакт неактивного электрода VEP и, таким образом, качество сигнала.
8. Расположите активные электроды ERG так, чтобы они слегка касались центральной поверхности роговицы с помощью микроманипулятора, прикрепленного к специально изготовленному стереотаксическому манипулятору.
9. Введите 2 - 5 мм заземляющего игольчатого электрода (нержавеющая сталь) подкожно в хвост.
10. При необходимости высушите лишнюю жидкость с нижнего века перед записью, чтобы улучшить качество сигнала.
11. Сдвиньте платформу ближе к миске Ганцфельда, убедившись, что глаза животного находятся на одной линии с отверстием миски, чтобы обеспечить равномерное освещение обеих сетчаток (см. шаг 2.4.1).
12. Закройте клетку Фарадея, чтобы уменьшить посторонние шумы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
крокодил	Бренд дженериков	НМ3022	Зажим из нержавеющей стали 26 мм для подключения винтовых электродов VEP к кабелям
Биоусилитель	Приложения	МЛ 135	Для усиления сигналов ERG и VEP
Карбоксиметилцеллюлоза натрия 1,0%	Аллерган	КАС 0009000-11-7	Вязкая жидкость для улучшения качества сигнала активного электрода ЭРГ
Карпрофен 0,5%	Группа по охране здоровья животных Pfizer	КАС 53716-49-7	Запатентованное название: Римадил инъекционный (50 мг/мл). Для послеоперационного обезболивания, разведенного до 0,5% (5 мг/мл) в обычном физиологическом растворе
Хлоргексадин 0,5%	Лаборатории Ориона	27411, 80085	Для дезинфекции хирургических инструментов
Циркуляционная водяная баня	Лауда-Кёнигсхоффен	MGW Lauda	Для поддержания температуры тела животного, находящегося под наркозом, во время хирургического вмешательства и электрофизиологической регистрации
Стоматологическая амальгама	ДегуДент ГмбХ	64020024	Для облицовки узла электрод-череп для повышения его прочности
Зубные заусенцы	Storz Instruments, Bausch and Lomb	#E0824A	Миниатюрная сверлильная головка диаметром ~0,7 мм для проделывания небольшого отверстия в черепе над каждой полусферой для вживления винтов VEP
сверло	Бош	Серия Dremel 300	Автоматическая дрель для трепанации
Электродный провод	Травяной телефактор	Ф-Э2-30	Платиновые кабели для подключения электродов серебряной проволоки к усилителю
Клетка Фарадея	заказной		Обеспечивает светонепроницаемость для адаптации к темноте. Включает в себя установку Ganzfeld для улучшения соотношения сигнал/шум
Марлевые тампоны	Мультигейт Медикал Продактс Пти Лтд	57-100В	Для подсушивания хирургического разреза и открытой поверхности черепа во время операции
Интегрирующая сфера Ганцфельда	Фотометрические решения Интернэшнл		Специально разработанный световой стимулятор: диаметр 36 мм, размер апертуры 13 см
VELCRO	VELCRO Австралия Пти Лтд	Многоразовая обертка VELCRO	Застежка-липучка для фиксации электродов и животного на записывающей платформе
Изофлуран 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	КАС 26675-46-7	Запатентованное название: ингаляционный анестетик Isoflo(TM). Фармацевтический ингаляционный анестетик в смеси с газообразным кислородом для имплантации электродов VEP
Кетамин	Лаборатории Трои	Подвздошная кэтамиль	Фирменное название: Кетамил Инъекции, Бренд: Подвздошная кость. Фармацевтический анестетик для электрофизиологической регистрации
Светодиоды Luxeon	Филлипс Лайтинг Ко.		Для световой стимуляции двадцать светодиодов по 5 Вт и один светодиод по 1 Вт.
микроманипулятор	Гарвардский аппарат	БС4 50-2625	Удерживает активный электрод ERG во время записи
Игольчатый электрод	Травяной телефактор	Ф-Э2-30	Подкожно вставляется в хвост в качестве заземляющего электрода для ERG и VEP
Фенилэфрин 2,5% минимс	Бауш и Ломб	КАС 61-76-7	Инстиллируется тропикамидом для достижения максимальной дилатации для регистрации ЭРГ
Повидон йод 10%	Санофи-Авентис	КАС 25655-41-8	Фирменное наименование: Бетадин, Антисептик для подготовки выбритой кожи к операции 10%, 500 мл
Система сбора данных Powerlab	Приложения	МЛ 785	Управление светодиодами
Проксиметакаин 0,5%	Лаборатории Alcon	КАС 5875-06-9	Для анестезии роговицы во время записи ЭРГ
Солевой раствор	Гельфлекс		Неинъекционный, для гальванического покрытия электродов из серебряной проволоки
Программное обеспечение Scope	Приложения	Версия 3.7.6	Одновременно запускает стимул через систему Powerlab и собирает данные
Серебро (тонкая круглая проволока)	Металлообработка и кондиционирование	0,3 мм	Используется для изготовления активных и неактивных электродов ЭРГ, а также неактивных электродов ВЭП
Винты с полосами из нержавеющей стали	МикроФастнеры		Диаметр стержня 0,7 мм, длина 3 мм для имплантации над первичной зрительной корой и использования в качестве активных электродов VEP
Стереотаксическая рама	Дэвид Копф	Модель 900	Стереотаксический инструмент для мелких животных для определения местоположения первичной зрительной коры в соответствии с координатами атласа мозга крыс Paxinos & Watson 2007 года
Хирургическое лезвие	Swann-Morton Ltd.	206	Для разреза участка кожи, перекрывающего первичную зрительную кору, для имплантации электродов VEP
шов	Шанхай Пудун Цзиньхуань Медикал Продактс Ко., Лтд		3-0 шелковый плетеный шовный нерассасывающийся, для втягивания кожи во время операции по имплантации электродов VEP
Тобрамицин глазная мазь 0,3%	Лаборатории Alcon	КАС 32986-56-4	Фирменное название: Tobrex. Профилактическая мазь с антибиотиками, наносимая вокруг кожной раны после операции
Тропикамид 0,5%	Лаборатории Alcon	КАС 1508-75-4	Фирменное название: 0,5% мидриациловые глазные капли, закапываемые для достижения мидриаза для регистрации ЭРГ
Ксилазин	Лаборатории Трои	Подвздошная ксилазила-100	Фармацевтический анестетик для электрофизиологической регистрации
Наконечник для пипетки	Компания Eppendorf Pty Ltd	0030 073.169 (Английский	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 мл, для электродов по индивидуальному заказу
Инъекция эвтаназии летабарбом	Virbac (Australia) Pty Ltd	LETHA450	325 мг/мл пентобарбитала натрия для быстрой эвтаназии
Microsoft Office Excel	Майкрософт	версия 2010	Программное обеспечение для работы с электронными таблицами для анализа данных