Брыжеечной артерии Сокращение и отдых Исследования с помощью автоматизированной миография провода

Краткое содержание

Автоматизированный метод миография для измерения силы в изолированных артерий брыжеечной описано. В нем занято Mulvany-Гальперн Авто Двойной Myograph провода 510A для определения ответов на фенилэфрин и внеклеточного кальция. Метод позволяет последовательно определения изометрической ответы на агонисты в мелких сосудах диаметром 60 - 300 мкм, независимо друг от друга.

Аннотация

Проксимальные сосуды сопротивления, такие как брыжеечные артерии, вносят существенный вклад в периферическое сопротивление. Эти мелкие сосуды диаметром от 100 до 400 мкм функционируют в первую очередь для направления кровотока к различным органам в соответствии с общими потребностями организма. Брыжеечная артерия крысы имеет диаметр более 100 мкм. Метод миографии, впервые описанный Малвеем и Халперном¹, был основан на методе, предложенном Беваном и Ошером². Методика дает информацию о мелких сосудах в изометрических условиях, где предотвращается существенное укорочение мышечной подготовки. Поскольку создание силы и чувствительность сосудов к различным агонистам зависят от степени растяжения в соответствии с активным соотношением напряжения и длины, важно проводить исследования сжатия в изометрических условиях, чтобы предотвратить податливость монтажных проводов. Проволока из нержавеющей стали предпочтительнее вольфрамовой проволоки из-за окисления последней, что влияет на регистрируемые отклики³. Методика позволяет сравнивать индуцированные агонистами сокращения смонтированных сосудов для получения доказательств нормального функционирования рецепторов гладких мышечных клеток сосудов.

В нескольких исследованиях мы показали, что изолированные брыжеечные артерии, которые сокращаются фенилэфрином, расслабляются при добавлении кумулятивных концентраций внеклеточного кальция (Ca²⁺_e). Полученные данные привели нас к выводу, что периваскулярные сенсорные нервы, которые экспрессируют^Ca2+-чувствительный рецептор (CaR), связанный с G-белком, опосредуют эту реакцию вазорелаксации. Используя метод автоматизированной проволочной миографии, мы показываем, что брыжеечные артерии крыс Wistar, солечувствительных (DS) и солеустойчивых (DR) крыс Dahl по-разному реагируют на Ca²⁺_e. Ткани крыс линии Wistar показали более высокую чувствительность к Ca²⁺ по сравнению с тканями крыс с DR и DS. Снижение экспрессии CaR в брыжеечных артериях у крыс с синдромом Дауна коррелирует со сниженной Ca²⁺e-индуцированной релаксацией изолированных, предварительно сокращенных артерий. Полученные данные свидетельствуют о том, что CaR необходим для расслабления брыжеечных артерий при повышенном адренергическом тонусе, как это происходит при гипертонии, и указывают на врожденный дефект сигнального пути CaR у животных породы Даля, который протекает гораздо тяжелее при синдроме Даля.

Метод полезен для определения сосудистой реактивности ex vivo в брыжеечных артериях сопротивления и подобных мелких кровеносных сосудах, и сравнение между различными агонистами и/или антагонистами может быть легко и последовательно оценено бок^{о бок 6,7,8}.

Протокол

1. Выделение крысы брыжеечной артерии небольшого

1. Обезболить животное с изофлуран в закрытую камеру и протрите живот спиртом.
2. Выполните средней линии лапаротомии выявить брыжеечной постели.
3. Использование ножницы, удалить около 85 см кишечника с кормлением сосудистую с верхней брыжеечной артерии. Вырезать проксимальный конец кишечной разделе близко к привратника и дистального конца ближайшем подвздошно-coecal перехода. Сегменты кишечника изолированы от крыс, которые являются глубоко под наркозом с изофлуран и эвтаназии путем открытой грудью пункции сердца.
4. Размещенные вырезали раздел покрытием чашке Петри содержащие PSS и выполнять рассечение брыжеечной артерии при комнатной температуре.
5. Придавить проксимальный конец кишки на правой стороне и пин-код из оставшейся части intestineina против часовой стрелки (ieproximal конце слева сосудистой питаются той стороне кишки).
6. Рассеките из филиала II и III сегментов вместе с куском проксимальном сегменте.
7. Рассеките из вены и артерии изоляции (с V-форму точки ветвления) и очистить его, удалив жировой и соединительной ткани. Избегайте прямого контакта с артерией, потянув осторожно пинцетом и резка через мембрану соединительной ткани.

2. Монтаж судно

1. Вырежьте два коротких сегментов (≈ 4 см) 40 мкм вольфрама без проволоки из нержавеющей стали и с тонкой щипцы, вставить один в просвет артерии каждого заботиться, чтобы не повредить эндотелий. Используйте провод наконечник, чтобы открыть просвет, если необходимо. Кровь потокового из сосуда является хорошим знаком просвет открыт.
2. Заполните myograph камеру с физиологическим раствором поваренной соли (PSS, мм: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 5 NaHCO _3, 1,2 K ₂ HPO _4, 1,1 Na ₂ HPO _4, 1,0 CaCl _2, 20 HEPES и 5 глюкозы, рН 7,4) с аскорбиновой кислотой (100 мкМ) при 37 ° C и с помощью щипцов тщательно передачи резьбовой сегмент судна из чашки Петри в камере при комнатной температуре и передачи вырезали проксимальный сегмент судна myograph камере и тянуть конца вдоль провода, чтобы кормить его в сосуд. Избегайте растяжения сосудов.
3. Безопасные ближнем конце провода против часовой стрелки при ближайшем винт крепления на правой челюсти связаны с микрометра. Поймать свободный конец проволоки пинцетом и закрепите его по часовой стрелке при далеко винт крепления на правой челюсти. Убедитесь, что судно сегменте вдоль провода находится в промежутке между челюстями без каких-либо контактов с челюстью себя.
4. Винт челюстей друг от друга, и выровняйте второй параллельной проволоки с судна и вставить его в дальнем конце просвета. Аккуратно кормить провод через просвет сосуда в одном сегменте движения с помощью уже смонтирован провод в качестве ориентира. Держите провод около 1 см от судна, чтобы избежать растяжения во время маневра, не дотрагиваясь до эндотелия.
5. Винт челюсти вместе и убедиться, что второй монтажный провод перемещается под первый залог правой челюсти.
6. Безопасные ближнем конце второй провод в направлении по часовой стрелке при ближайшем винт крепления левой челюсти подключен к преобразователю.
7. Безопасные дальнем конце провода под крепежный винт с левой стороны челюсти и затянуть, чтобы протянуть провода.
8. После завершения монтажа, сброс двигателя в "Монтаж Меню" и начать нормализацию судна.

3. Нормализация

Авто Двойной Myograph проводная система-510A имеет автоматизированную функцию нормализации, который оценивается от "нормализации" в меню и позволяет судну быть растянут на нормированные внутренней окружности, стандартизированные процедуры в соответствии с протоколом производителя после уравновешивания в течение 30 мин при 37 ° C. Экспоненциальная кривая затем установлены на внутренние данные давления окружности. Процедура определяет диаметр просвета (D 100), что артерии имело бы в естественных условиях, когда расслабился и под трансмуральный давление 100 мм рт.ст. ¹ нормализации параметров крысы брыжеечной артерии состоят в следующем.:

1. Целевая трансмуральный давление = 13,3 кПа (100 мм рт.ст.).
2. Время = 60 сек, продолжительность каждого из нормализации шаги.
3. IC ₁ / IC ₁₀₀ = 0,9 (IC ₁ = нормированного внутренней окружности, IC ₁₀₀ = внутренняя окружности соответствующего целевого давления.
4. Окуляр калибровки 2 * Δ (мм / глазных деление), 2 дельта для программирования причинам.

Измерьте длину установлен брыжеечной артерии использованием микроскопа окуляра чтениях, когда волоски более ближнего и дальнего концов установлен сосуд SEGMENT. Короче говоря, длина судна установлен сегмент измеряется при максимальном увеличении, используя калиброванный глазного окуляра в микроскопе рассечение. Окуляр чтение с волосами линию над дальнем конце сегмента ₍₁₎ и ближнем конце сегмента ₍₂₎ в глазной подразделения измеряется и регистрируется. Эти ценности, с показаниями микрометра, до и после растяжения сосудов документально оформлены и введены в меню для программы для расчета установлены кривой и внутренний диаметр соответствующей целевой трансмуральный давление 100 мм рт.ст.

В наших исследованиях артерий были настроены на просвет диаметром D ₁ = 0,9 XD _100, где активное развитие сила максимальна. Активное развитие силы ≥ 10 мН в артериях крыс брыжеечной считается оптимальной для экспериментов, чтобы продолжить. Ткани с более активной силой были отброшены.

4. Измерение ответы

После нормализации, механические и функциональные свойства сосудов вновь активирована, выполняя «стандартный старт", которая включает в себя сложные суда повторного применения (обычно 2 или 3) 5 мкМ фенилэфрин (ПЭ) для получения воспроизводимых сокращений. Типичный "стандартный старт" в нашей лаборатории состоит из серии стимуляций и вымывания периоды следующим образом:

1. Замените myograph камеру крышкой и начать аэрации с 95% воздуха и 5% СО _2.
2. Заполнить камеру со свежими PSS (содержащий 100 мкМ аскорбиновой кислоты)
3. Договор судно с 5 мкМ PE в течение 5 мин и мыть 4 раза PSS буфера.
4. После последней стирки, заправка камера с PSS и подождать 3 минуты, прежде чем повторять шаги (II) и (III).

После стандартного начала артерии готов к эксперименту. Релаксаций контракту судов оцениваются путем кумулятивного добавления возрастающих концентрациях CaCl ₂ (0,5 - 4 мм). Когда ингибиторов используются суда предварительно инкубировали с соединениями в myograph камере в течение 20 мин и присутствовать во время анализов.

5. Анализ данных

"Нормализация" данные для судов и силы обводка, непосредственно преобразуется в текстовые данные были проанализированы с SigmaPlot 11,0 графические программы (Systat Software, Поинт Ричмонд, штат Калифорния) и на графике как показано на рисунке 1. Концентрация данных о реакции, рассчитанная по обводка, были проанализированы определения ЭК ₅₀ значений от экспериментальных данных установлены на четырех параметров логистической функции в фармакологии меню программы. Сравнения между группами и внутри групп были проведены One Way дисперсионного анализа (ANOVA) и различия при р <0,05, считаются существенными.

6. Представитель Результаты:

Параметры	Вистар	Даль Соль-Sensitive	Даль солеустойчивые
L 100 (мкм)	83,26 ± 2,33	91,52 ± 4,67	117,45 ± 8,43 *
X 1	604,21 ± 41,97	752,24 ± 85,25	745,84 ± 110,09
R 2	0,99 ± 0,003	0,97 ± 0,008	0,97 ± 0,007

* Разница между L ₁₀₀ значений для Вистар и DR являются статистически значимыми. Шапиро-Wilk нормальность тест пройден (р = 0,588); равных Испытание прошло отклонений (р = 0,237).

L ₁₀₀ = Внутренний диаметр установлен соответствующий сегмент целевой трансмурального давления.

X ₁ = микро настройку позиционера необходимо растянуть установлен судна нормированной внутренней окружности (т.е. значение микрометра чтения, на которых были проведены эксперименты).

R ² = коэффициент регрессии для приступе (X _я, Y _я) для экспоненциальной кривой.

NB: подробная процедура описана в руководстве по 510A Система Myograph ^6.

Таблица 1. Пример считывания нормализации параметров брыжеечной артерии из сегментов линии Вистар, DS и DR из основных программа, показанная в "Нормализация Меню". Значения средства (± SEM) от 5 животных. * Различия между L ₁₀₀ значений для Вистар и DS являются статистически значимыми (р <0,05).

Вистар	DS	DR
14,2 ± 0,6		20,9 ± 1,3 *

Таблица 2. Развитые напряженности (MN) в брыжеечных артерий изолированы от линии Вистар, DS и DR крыс, следующие приложения 5 мкМ PE для каждого судна. Значения представляют собой средства (± SEM) из 6-8 животных. * Значительно отличается от линии Вистар контроля (р <0,05).

Рисунок 1. Ca ^{2 ₊ е-индуцированной} релаксации PE-контракт брыжеечной артерии крысы Вистар установлен в проволоку myograph в физиологическом растворе соли, содержащей 1 мМ Ca ^{2 +.} Артерия была уравновешенной в течение 30 мин при 37 ° С с постоянной аэрации и ответы на Ca ^{2 ₊ е} определен. Представитель сил трассировки при добавлении 5 мкМ PE следуют кумулятивные дополнения Са ^{2 +,} показано на рисунке.

Рисунок 2. Ca ^{2 ₊ е-индуцированной} релаксации PE-контракт брыжеечной артерии крысы DS установлен в проволоку myograph в физиологическом растворе соли, содержащей 1 мМ Ca ^{2 +.} Артерия была уравновешенной в течение 30 мин при 37 ° С с постоянной аэрации и ответы на Ca ^{2 ₊ е} определен. Представитель сил трассировки при добавлении 5 мкМ PE следуют кумулятивные дополнения Са ^{2 +,} показано на рисунке. Са ^{2 +} отдых был сильно скомпрометирован в этой ткани по сравнению с теми из Вистар и крыс DR.

Рисунок 3. Ca ^{2 _{+ е-индуцированной}} релаксации PE-контракт брыжеечной артерии от крыс DR устанавливается в проволоку myograph в физиологическом растворе соли, содержащей 1 мМ Ca ^{2 +.} Артерия была уравновешенной в течение 30 мин при 37 ° С с постоянной аэрации и ответы на Ca ^{2 ₊ е} determined.A представитель силу трассировки при добавлении 5 мкМ PE следуют кумулятивные дополнения Са ^{2 +,} показано на рисунке.

Рисунок 4. А. [Са 2 +] е-ответ кривые. Б. Гистограмма показывает EC 50 для релаксации определяется путем подгонки данных четыре параметра логистической выражение curve.C.CaR в брыжеечных аркад изолированы от DR и DS крыс.

Обсуждение

Гипертония является одной из основных причин сердечно-сосудистых, церебральных и почечных заболеваемости / смертности. Возникновения гипертонии высок среди населения и соль-чувствительной гипертонии особенно высока в старение населения, и более распространенным в черных, чем белых. Это, как полагают, связано с тенденцией черных сохранить натрия в почках ^9. Солт-чувствительность является одним из основных факторов, способствующих болезни почек и ассоциируется с эндотелиальной дисфункции, но механизм до конца н...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Наименование оборудования / реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Авто Двойной Myograph проводная система-510A DMT-США, Inc	Атланта, штат Джорджия.	100151
PowerLab/4SP системы сбора данных	ADInstruments, Колорадо-Спрингс, CO	ML750	Новые модели с 4-16 входных каналов имеются.
Dell Dimension XPS Gen 4 Компьютер	Лощина
Stemi С. В. II (APO) Препарирование микроскоп с Глазные	Carl Zeiss International.
Вистар, Даль соль-чувствительной, Даль солеустойчивые крыс	Харлан Sprague Dawley, Индианаполис, IN.
Грызун чау	Харланд Tekland, Мэдисон, Висконсин.
Фенилефрин	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
Другие химикаты			Все химические вещества, используемые были чистейшей классы имеются в продаже.