1. Настройка аппарата для дозатора
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе есть пять основных компонентов: стеклянная пипетка, трубка, шприц, микроманипулятор и буфер (Хэнка) Таблица 1. Любой буфер, который имеет физиологически значимые концентрации солей, может быть использован в этой конфигурации.
- Вытяните боросиликатную пипетку так, чтобы он имел открывающийся наконечник диаметром около 45 мкм, используя съемник микропипеток в соответствии со спецификациями, приведенными в таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Было обнаружено, что 45 μм является подходящим размером для диаметра отверстия пипетки в экспериментальных условиях. Незначительные изменения в размере отверстия не должны существенно повлиять на результаты. Важно отметить, что большие отклонения от этого числа все еще должны работать для индукции варикозного расширения вен путем регулировки высоты шприца, который соединен с пипеткой через трубку, но для этого потребуется повторная калибровка значения давления.
- Вставьте невытянутый конец пипетки в тонкую резиновую трубку.
заметка: Стенка трубки должна быть тонкой и жесткой, чтобы свести к минимуму сопротивление жидкости, гарантируя, что высота шприца прямо пропорциональна давлению жидкости, протекающей через пипетку с пренебрежимо малым сопротивлением. Трубка должна быть не длиннее примерно 0,6 м в длину, чтобы еще больше минимизировать сопротивление.
- Подсоедините другой конец трубки к пластиковому шприцу объемом 10 мл через соединитель с поворотным клапаном.
заметка: Пластиковый шприц необходимо держать на постоянной, измеряемой высоте, чтобы обеспечить точное измерение предполагаемого давления, исходящего из пипетки. Была использована высота 190 мм, так как это обеспечивает минимальное давление, но надежно вызывает варикозное расширение аксонов. Другие значения высоты также могут использоваться, если давление приводит к отделению ячеек от поверхности покровного стекла. Рекомендуется использовать одну и ту же настройку на протяжении всего эксперимента.
- Вставьте пипетку в завинчивающуюся верхнюю часть микроманипулятора, чтобы удержать пипетку на месте. Прикрутите металлический винт с плоским верхом, прикрепленный к руке микроманипулятора, так, чтобы он удерживал невытянутый конец пипетки прямо над местом крепления резиновой трубки. Наклоните пипетку под углом 45° к поверхности нейронсодержащих покровных стекол. ПРИМЕЧАНИЕ: Микроманипулятор должен быть сконструирован таким образом, чтобы пипетку можно было держать, не сжимая резиновую трубку. Микроманипулятор должен обеспечивать движение пипетки в направлениях x, y и z, чтобы точно расположить ее в пределах досягаемости клеток. График и фотография аппарата представлены ниже (Рисунок 1).
- Включите флуоресцентный фильтр, откройте диафрагму и убедитесь, что через объектив видно флуоресцентное пятно. С помощью микроманипулятора переместите пипетку в положение, которое совпадает с флуоресцентным пятном, и опустите пипетку в положение, расположенное чуть выше высоты чашки для клеточной культуры (35 мм x 10 мм). Как только он будет на месте, включите проходящий свет и выключите флуоресценцию.
- С помощью пинцета добавьте одну защитную пленку (так, чтобы клетки были обращены вверх к пипетке) с планшета для клеточной культуры в чашку для клеточных культур, содержащую около 2 мл буфера Хэнка при комнатной температуре.
- Поместите чашку с культурой с покровным стеклом на эндоскоп.
- Используя ручку точной фокусировки и 20-кратный объектив, сфокусируйтесь на плоскости примерно на четыре полных оборота над ячейками (около 0,4 мм). С помощью микроманипулятора расположите наконечник пипетки так, чтобы он был сфокусирован и находился в центре, слева от плоскости, если смотреть через окуляры.
заметка: Дендриты — это проекции, которые должны находиться в той же рамке, что и тело клетки, из которого они происходят. Чтобы вызвать варикозное расширение вен аксонов, следует проследить более длинные проекции от тела клетки к медиальным и дистальным аксонам.
2. Калибровка давления пипетки с помощью системы с растягивающейся мембраной
- Установите аппарат для дозатора с точно такими же параметрами, как описано выше, на системе, содержащей микроизготовленную силиконовую мембрану (диаметром 500 мкм и толщиной 50 мкм) и сфокусируйте микроскоп на поверхности мембраны><.
заметка: Эта система была разработана для измерения малых значений давления, и объяснение системы было опубликовано ранее. Это измерение необходимо выполнить только один раз для экспериментов с затяжкой, если используется точно такая же настройка затяжки.
- Сфокусируйте микроскоп на массивах микроточек (4 мкм в диаметре и 10 мкм друг от друга, измеренных между центрами). Поверните запорный клапан и дайте жидкости вытечь из пипетки. Исследуйте прогиб мембраны в ответ на давление жидкости с помощью конфокального микроскопа.
- Используйте линейную модель для определения соответствующего давления, связанного с прогибом мембраны.
заметка: В то время как недавнее исследование показало, что отклонение w= -3,143 ± 0,69 мкм было получено при высоте шприца 190 мм, это привело к давлению 0,25 ± 0,06 нН/мкм2 от текущей конфигурации пипетки, что находится в пределах физиологического и патологического диапазона, хотя высота шприца не является единственным определяющим фактором. На точное значение давления на нейроны влияют и другие факторы, в том числе отверстие пипетки, положение (расстояние и угол) наконечника пипетки относительно клеток и даже гибкость трубки.
3. Отечность для стимуляции варикозного расширения вен
- Когда пипетка будет на месте, сфокусируйте микроскоп на плоскости, содержащей интересующую область. Расположите клетки и отростки в левой половине поля изображения (видимой при съемке камеры в реальном времени) в зоне отдувания, в то время как правая половина находится за пределами зоны оттяжения.
заметка: Из-за обширного разрастания аксонов и дендритов нейронов маловероятно, что все отростки нейрона находятся в пределах одной и той же области отрастания. На самом деле это одно из преимуществ данной системы, которое позволяет исследовать локальный эффект затяжки. Существует два типа отечения, которые можно использовать для индукции варикозного расширения: длительное отечное расширение и пульсовое отечное.
- Пыхтя
- Длительная затяжка
- Расположите шприц на высоте, на 190 мм над покровным стеклом, содержащим культивируемые нейроны. Начните покадровую визуализацию области интереса с оптимизированным временем экспозиции, чтобы выявить четкую морфологию нейронов. Захватите не менее 15 кадров с интервалом 2 с (всего 30 с) в качестве базового уровня. Интервал можно корректировать в зависимости от эксперимента. На раме 16 откройте поворотный запорный клапан шприца и дайте жидкости течь в течение 75 кадров (150 с). На раме 75 закройте клапан, чтобы поток жидкости прекратился. Остановка захвата видео.
Примечание: Это должно вызывать варикозное расширение вен аксонов в нейронах 7-9 DIV в течение 5-10 секунд, в то время как более старым нейронам требуется больше времени для формирования варикозного расширения.
- Пульс (продолжительность 2 с) пыхтение
- Расположите шприц на нужной высоте (190 мм). Начните цейтраферную съемку и захватите не менее 15 кадров (30 с) с интервалом в 2 с. На раме 16 откройте клапан шприца и дайте жидкости стечь, затем закройте клапан через 2 с. Подождите 5–20 с (в зависимости от частоты, которую необходимо проверить), прежде чем снова открыть клапан. Повторите открытие и закрытие клапана для создания импульсов жидкости, и продолжайте в течение общего периода 150-300 с. Продолжайте покадровую съемку в течение 20 минут, чтобы запечатлеть стадию восстановления.
заметка: Когда интервал превышает 10 с, импульсы вызывают значительно меньше варикозных расширений. С интервалом в 20 секунд импульсы не могут вызвать варикозное расширение вен. Для получения надежного и стабильного образования варикозного расширения вен рекомендуется, чтобы высота шприца составляла около 190 мм. Высота шприца и давление жидкости не должны подниматься до такой степени, чтобы ячейки начали отделяться от поверхности покровного стекла.
- Перед использованием очистите установку (пипетку, трубку и шприц), пропустив через нее около 10 мл 70% этанола. После промывки этанолом пропустите 10 мл буфера Хэнка (или желаемого буфера) через установку, чтобы подготовить систему к использованию в этот день. После завершения экспериментов в течение дня очистите установку, как описано ранее, с помощью этанола, чтобы предотвратить рост загрязняющих веществ в течение ночи.
Таблица 1: Рецепт буфера Хэнка. По этому рецепту подготавливается буфер, используемый в протоколе оттяжения и во время визуализации живых клеток.
| Буфер Хэнка (фильтр, pH = 7,4, хранить при 4 °C |
| 150 мМ | NaCl |
| 4 мМ | KCl |
| 1,2 мМ | MgCl2 |
| 1 мМ | CaCl2 |
| 10 мг/мл | D-глюкоза |
| 20 мМ | ХЕПЕС |
Таблица 2: Параметры вытягивания пипетки. Предоставляет параметры, которые должны быть установлены на съемнике пипеток для получения отверстия диаметром около 45 мкм.
| Параметры вытягивания пипетки |
| жара | тянуть | скорость | задержка | давление | рампа |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
