$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Стереотаксическая инжекция сетчатой электроники в мозг живой мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам вводили обезболивание путем внутрибрюшинной инъекции смесью 75 мг/кг кетамина и 1 мг/кг дексдомита. Степень анестезии была проверена с помощью метода щипкования пальца ноги до начала операции. Температуру тела поддерживали путем помещения мыши на гомеотермическое одеяло при температуре 37 °C во время анестезии. Для операции была применена надлежащая стерильная техника, включая, помимо прочего, автоклавирование всех металлических хирургических инструментов в течение 1 часа перед использованием, использование стерилизованных перчаток, использование стерилизатора горячих шариков на протяжении всей операции, поддержание стерильного поля вокруг операционного поля, дезинфекцию пластиковых инструментов 70% этанолом, а также подготовку депилированной кожи головы йодофором перед разрезом. Для операций по выживанию, после завершения операции, вокруг раны наносили мазь с антибиотиком, и мышь возвращали в клетку, оборудованную грелкой с температурой 37 °C. Мышей не оставляли без присмотра до тех пор, пока они не приходили в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. Мышам вводили анальгезию бупренорфином путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 0,05 мг/кг массы тела каждые 12 ч в течение 72 ч после операции. Мыши были изолированы от других животных после хирургического вмешательства. Мышей усыпляли либо путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала в дозе 270 мг/кг массы тела, либо с помощью транскардиальной перфузии.
- Обезболите мышь и зафиксируйте ее в стереотаксической рамке.
- Нанесите глазную смазку на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Используйте бормашину и стереотаксическую рамку, чтобы открыть трепанацию черепа в нужных координатах на черепе. Откройте второй трепанацию черепа вдали от места инъекции для введения заземляющего винта или проволоки из нержавеющей стали.
- Закрепите прижимную подложку к черепу с помощью стоматологического цемента. Вырежьте зазор шириной примерно 1 мм в подложке, чтобы повысить надежность этапа складывания на более поздних этапах процедуры.
заметка: Плоский гибкий кабель (FFC), обрезанный по форме буквы «L», подходит хорошо (рис. 4A), хотя многие материалы подойдут, если они имеют правильную толщину для 32-канального разъема с нулевым усилием вставки (ZIF) (предназначенного для кабелей толщиной 0,18 ± 0,05 мм).
- Установите держатель пипетки с иглой, содержащей сетчатую электронику, на стереотаксическую рамку с помощью углового концевого зажима (рис. 2C и рис. 3A).
- Присоедините боковое отверстие держателя для дозатора к шприцу объемом 5 мл, закрепленному в шприцевом насосе (рисунок 3D) с помощью капиллярной трубки длиной примерно 0,5–1 м.
заметка: Убедитесь, что в капиллярной трубке нет пузырьков, прежде чем подключать ее к держателю для дозатора. Пузырьки могут прерывать поток во время впрыска и препятствовать плавной, контролируемой доставке сетчатой электроники.
- Используйте стереотаксическую рамку, чтобы расположить кончик иглы в нужном начальном месте в мозге.
заметка: Используемые здесь пробники ячеистой электроники имеют регистрирующие электроды, расположенные на расстоянии около 2 мм, причем первый электрод расположен примерно в 0,5 мм от начального края сетчатой электроники (крайний левый край на рисунке 1A). По этой причине стереотаксические координаты должны быть выбраны таким образом, чтобы начальное положение находилось на 0,5 мм глубже интересующей области мозга. Распределение и расположение записывающих электродов в сетчатой электронике может быть свободно выбрано в процессе проектирования маски и должно быть выбрано таким образом, чтобы записывающие электроды охватывали интересующую область (области) мозга при их введении по стереотаксической траектории.
- Расположите камеру (рис. 3B) так, чтобы верхняя часть датчика сетчатой электроники отображалась внутри стеклянной иглы. Некоторые программы позволяют пользователю нарисовать линию на экране, чтобы отметить исходное положение электроники сетки.
- Запустите поток, установив шприцевой насос на низкую скорость и нажав кнопку Start. 10 мл/ч является типичной начальной скоростью потока для капиллярной иглы внутреннего диаметра 400 мкм. Медленно увеличивайте расход, если сетчатый электронный щуп не перемещается внутри иглы.
заметка: Важно свести к минимуму объем жидкости, вводимой в мозг, так как это может повредить ткани, окружающие место инъекции. Наилучшие результаты достигаются при объемах впрыска менее 25 μл на 1 мм длины инъектируемой ячейки. Идеальные значения составляют менее половины этого объема; В нашей лаборатории мы обычно вводим 10–50 μL на длину введенной ячейки 4 мм.
- Когда датчик сетчатой электроники начнет двигаться внутри иглы, используйте стереотаксическую рамку для втягивания иглы с той же скоростью, с которой вводится датчик сетчатой электроники, используя отмеченное исходное положение электроники сетки в качестве ориентира.
заметка: Эта процедура, называемая методом инъекции поля зрения (FoV), позволяет точно доставлять сетчатую электронику в целевую область мозга без смятия или смещения. Часто скорость потока может быть уменьшена, как только сетчатый электронный зонд начинает двигаться внутри иглы. В нашей лаборатории для преодоления статического трения между сеткой и стенками капиллярной иглы часто требуется скорость потока 20–30 мл/ч, но затем скорость может быть снижена до 10 мл/ч после начала процесса инъекции. Скорость потока и объемы инъекций обычно меньше для капиллярных игл меньшего диаметра.
- Продолжайте вводить физиологический раствор и втягивать иглу до тех пор, пока игла не выйдет из черепа. Остановите поток из шприцевого насоса.
2. Вход/выход
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ячеистый электронный зонд был введен из желаемой начальной точки в мозге по выбранной траектории. Игла была втянута и находится прямо над краниотомией, а сетчатые электронные соединения простираются от мозга к игле, а входные/выходные (I/O) прокладки все еще находятся внутри иглы (Рисунок 4B). В этом разделе используется печатная плата (PCB; Рисунок 4, Рисунок 5) для сопряжения с сетчатым электронным щупом. Печатная плата соединяет разъем ZIF с 32-канальным стандартным разъемом усилителя через изолирующую подложку, которая становится головным столиком для экспериментов по нейронной записи. Печатная плата может быть настроена для размещения различных конфигураций головной сцены. Наши файлы дизайна доступны по запросу или на веб-сайте ресурса, meshelectronics.org, и могут быть использованы для недорогой покупки печатных плат у поставщиков услуг по производству и сборке печатных плат.
- Используйте стереотаксическую рамку, чтобы осторожно направить иглу к зажимной подложке FFC и через зазор, протекая раствор с помощью шприцевого насоса, чтобы создать слабину в межсоединениях электроники сетки (Рисунок 4C).
- Как только игла окажется над зажимной подложкой и через зазор, возобновите поток с высокой скоростью, чтобы вытолкнуть контактные площадки ввода-вывода сетчатой электроники на зажимную подложку (Рисунок 4D).
- С помощью пинцета и пипетки с деионизированной водой (DI) согните контактные площадки ввода-вывода под углом около 90° как можно ближе к первой площадке ввода-вывода.
заметка: Изгиб необходим для того, чтобы контактные площадки можно было вставить в разъем ZIF на печатной плате на последующем этапе. Разъем ZIF имеет точно такую же ширину, как и 32 контактные площадки ввода-вывода сетчатого электронного пробника, поэтому неидеальный изгиб на 90° или изгиб, не происходящий прямо перед первой площадкой ввода-вывода, приведет к необходимости отрезать контактные площадки ввода-вывода (крайние левые контактные площадки на рисунке 4E).
- После того, как контактные площадки ввода-вывода выровнены, развернуты и расположены под углом 90° к сетчатому стержню, просушите их на месте с помощью мягко проточного сжатого воздуха.
заметка: Пробники ячеистой электроники с менее чем 32 каналами могут подключаться к одной и той же 32-канальной интерфейсной плате. Например, в нашей лаборатории обычно используются 16-канальные ячеистые электронные пробники с 32-канальными печатными платами. Это обеспечивает дополнительное пространство внутри разъема ZIF, облегчая взаимодействие, а дополнительные неконтактные каналы легко идентифицируются как разомкнутые цепи с помощью тестирования импеданса во время сеансов записи.
- Разрежьте зажимную подложку по прямой кромке примерно в 0,5–1 мм от края контактных площадок ввода-вывода. Также отрежьте посторонние части зажимной подложки, которые будут препятствовать вставке в установленный на печатной плате 32-канальный разъем ZIF (рис. 4F).
- Вставьте контактные площадки ввода-вывода в разъем ZIF на печатной плате и закройте защелку (рис. 4G). Используйте измерительную электронику для измерения импеданса между каналами и винтом заземления, чтобы подтвердить успешное сопряжение. Если значения импеданса слишком высоки, разблокируйте разъем ZIF, отрегулируйте вставку и повторите проверку до тех пор, пока не будет подтверждено успешное подключение.
- Для защиты закройте разъем ZIF и открытые сетчатые электронные соединения стоматологическим цементом. Переверните печатную плату в зазоре в подложке и закрепите печатную плату цементом на черепе мыши (Рисунок 4H).
заметка: Изгиб FFC в зазоре снижает механическую нагрузку, которая иногда может нарушить межсоединения электроники сетки.
- Дайте цементу застыть, превратив печатную плату в прочную, компактную головную сцену для взаимодействия во время последующих сессий записи (Рисунок 4I).
3. Эксперименты с нейронной записью
- Поместите мышь в хвостовой прожилку или другой ограничитель. Вставьте печатную плату предусилителя в стандартный разъем усилителя на печатной плате головного каскада. Используйте отдельный кабель для заземления опорного винта.
- Для удержания записи оставьте мышь в удерживающем устройстве. Запишите данные с помощью системы сбора данных за нужный период (рисунок 5A).
- Для свободного перемещения записей освободите мышь от ограничителя после установки печатной платы предусилителя и заземления эталонного винта. Запись в течение желаемого периода времени с помощью системы сбора данных, в то время как мышь ведет себя свободно (рис. 5B)
