Создание конфигурации напряжения-зажима для всей клетки для электрофизиологических записей в срезах мозга

Аннотация

Источник: Sunstrum, J. K., et al. Оценка синаптической множественности с помощью электрофизиологии патч-хомп для целых клеток. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует размещение тонкоконечной пипетки рядом с срезами мозга, образуя уплотнение с нейронной клеткой. Всасывание разрушает клеточную мембрану, тем самым создавая зажим для всей клетки, который позволяет измерять ток для электрофизиологических экспериментов.

Протокол

Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Решения

1. Решение для нарезки
   1. Состав раствора для нарезки см. в таблице 1.
   2. Заранее приготовьте 20-кратный исходный раствор и храните его при температуре 4 °C до 1 месяца.
   3. Для 1x раствора для нарезки растворите NaHCO₃, глюкозу и сахарозу в ddH₂O и добавьте 20x бульон. Убедитесь, что осмолярность находится в диапазоне от 315 до 320 мОсм, и храните раствор не более 1 недели при температуре 4 °C.
   4. Наполните два стакана 100 мл раствора для нарезки и накройте их парапленкой. Охладите раствор в морозильной камере до частичного замерзания (примерно 20 минут в морозильной камере при температуре -80 °C). С помощью газодисперсионной трубки в течение 20 минут налейте на лед оба стакана раствора для нарезки с 95% O2/5% CO2.
2. aCSF (искусственная спинномозговая жидкость), для восстановления и поддержания срезов
   1. В таблице 1 представлен состав aCSF.
   2. Заранее приготовьте 20-кратный исходный раствор и храните его при температуре 4 °C до 1 месяца.
   3. Для 1x aCSF растворите NaHCO3 и глюкозу в ddH2O и добавьте 20x stock. Убедитесь, что осмолярность находится в пределах 298-300 мОсм. Используйте раствор в течение 1 суток.
3. aCSF (низкий Ca²⁺ для записи)
   1. В таблице 1 представлен состав аминокислот с низким содержанием^Ca2+ aCSF.
   2. Заранее приготовьте 20-кратный исходный раствор и храните его при температуре 4 °C до 1 месяца.
   3. Для получения 1x низкого^Ca2+ aCSF растворите NaHCO3 и глюкозу в ddH2O и добавьте 20x (CaCl2 и MgCl2 free) запас, CaCl2 и MgCl2 до указанных концентраций. Убедитесь, что осмолярность находится в пределах 298-300. Используйте раствор в течение 1 суток.
4. aCSF (Sr²⁺ для записи)
   1. В таблице 1 приведен состав Sr²⁺ aCSF.
   2. Заранее приготовьте 20-кратный исходный раствор и храните его при температуре 4 °C до 1 месяца.
   3. Для 1x Sr²⁺ aCSF растворите NaHCO3 и глюкозу в ddH2O и добавьте 20x (CaCl2 и MgCl2 free) исходных концентраций, SrCl2 и MgCl2 до указанных концентраций. Убедитесь, что осмолярность находится в пределах 298-300. Используйте раствор в течение 1 суток.
5. Внутреннее решение
   1. В таблице 1 приведен состав внутреннего раствора на основе K-глюконата.
   2. Чтобы приготовить 20 мл внутреннего раствора, добавьте 15 мл воды, пригодной для молекулярной биологии, в 50 мл пробирки. Затем выполните последующие шаги на льду.
   3. Приготовьте следующие растворы заранее до 1 М концентрации запаса в воде молекулярной биологии. Добавить (в мл): 2,32 K-глюконата, 0,24 Na-глюконата, 0,20 HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновую кислоту), 0,16 KCl, 0,05_K2-EGTA (Калиэтиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота), 0,04 MgCl2 в 50 мл пробирки.
   4. Добавьте 100 мкл 0,3 M Na₃GTP (гуанозин-5'-трифосфатная натриевая соль)
   5. Взвесьте 44,08 мг K2 АТФ (аденозин-5'-трифосфат дикалий) в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и добавьте 1 мл воды, пригодной для молекулярной биологии, затем добавьте в пробирку объемом 50 мл.
   6. Отрегулируйте pH до 7,2-7,4 с помощью 1 М KOH. Убедитесь, что осмолярность находится в пределах 283-289 мОсм.

2. Приготовление ломтиков

1. Подготовьте инструменты
   1. Добавьте 200 мл аКСФ в камеру восстановления (изготовленную из стакана объемом 250 мл с 4 лунками и сеткой) и поместите камеру восстановления на водяную баню (35 °C).
   2. Накройте камеру парафиновой пленкой и постоянно пузыритесь в коксофоне с 95% O2/5% CO2 с помощью стеклянной дисперсионной трубки в течение не менее 20 минут.
   3. Установите инструменты для препарирования (скальпель, наклонные ножницы, щипцы, тонкая кисть, пластиковая ложка).
   4. Наполните шприц объемом 60 мл примерно 15 мл раствора для ледяной нарезки, как показано на шаге 1.1.4.
   5. Подготовьте платформу для вскрытия, положив фильтровальную бумагу на крышку лунной пластины.
   6. Подготовьте камеру для нарезки, поместив ее в лоток для льда и заполнив лоток льдом.
   7. Настройте вибратом, закрепив одноразовое лезвие в держателе лезвия.
   8. Чтобы сделать переводную пипетку, сломайте кончик пастеровской пипетки и поместите резиновую грушу на сломанный конец.
2. Препарирование мозга мыши
   1. Обезболивают животное в камере, насыщенной 4% изофлураном, до тех пор, пока спинномозговые рефлексы не исчезнут.
   2. Обезглавьте животное с помощью гильотины и быстро удалите мозг.
      1. Сделайте разрез по средней линии лезвием скальпеля No 22 от рострального к каудальному.
      2. Сбоку отшелушите кожу головы с каждой стороны головы.
      3. Используйте тонкие ножницы, чтобы разрезать череп с одной стороны от каудальной до ростральной (включая боковую сторону лобных костей), соблюдая осторожность, чтобы не повредить мозг.
      4. С помощью щипцов приподнимите часть черепа от мозга и быстро охладите мозг 15 мл ледяного раствора для нарезки с помощью шприца из шага 2.1.4.
      5. Поднимите мозг из черепа.
      6. Поместите мозг в один из стаканов, наполненный ледяным раствором для нарезки (из шага 1.1.4), наполненным 95% O2/5% CO2.

3. Приготовьте ломтики мышиного гипоталамуса.

1. Заблокируйте мозг для желаемой области мозга и угла разреза (например, для корональных разрезов гипоталамуса обрежьте ткань рострально до зрительного хиазма и каудально до моста с помощью лезвия и убедитесь, что каудальный блок имеет плоскую поверхность, перпендикулярную основанию мозга).
2. С помощью отрезанного куска фильтровальной бумаги подхватите мозг с передней стороны и приклейте заднюю сторону к удерживающей пластине с помощью мгновенного клея.
3. Быстро поместите удерживающую пластину в камеру для нарезки и заполните ее раствором для нарезки из второго стакана на шаге 1.1.4.
4. Закрепите камеру для нарезки и лоток для льда на вибратоме.
5. Определите область среза (спереди и сзади от мозга) и начните срезать корональные срезы толщиной 250 мкм. Рекомендуемые параметры: скорость 0,10 мм/с, амплитуда 2 мм.
6. Обрежьте ломтики до размера, соответствующего желаемой области мозга.
7. Восстановите ломтики при температуре 35 °C в течение 30-45 минут. Затем выньте камеру восстановления из согревающей ванны и дайте ломтикам восстановиться при комнатной температуре еще 30 минут. Храните ломтики при комнатной температуре до конца дня и продолжайте постоянно пузырить ванну с 95% O2/5% CO2.

3. Патч-зажим для целых клетокЗапись

1. Потяните за пластырь пипетки.​
   1. Используя предложенные параметры для записи всей ячейки из инструкции к съемнику пипетки, вытяните патч-пипетки из толстостенного стекла с сопротивлением пипетки 3-5 МОм.
   2. С помощью микрошприца (коммерческого или самодельного) наполните наконечник пипетки отфильтрованным внутренним раствором. Чтобы сделать микрошприц, сожгите кончик шприца объемом 1 мл и дайте кончику упасть, создавая длинный тонкий наконечник.
2. Получите конфигурацию целых ячеек.
   1. Поместите записывающую пипетку чуть выше среза и сместите ток пипетки в режиме клещей напряжения. Слегка надавите на пипетку и заблокируйте запорный кран.
   2. Выберите здоровую клетку с интактной мембраной и подойдите к ней с помощью пипетки. Положительное давление должно вызывать небольшое нарушение в тканях (т.е. медленную волну в тканях при входе).
   3. Медленно продолжайте приближать пипетку к ячейке диагональными движениями до тех пор, пока пипетка не образует небольшую ямочку на поверхности клетки.
   4. Отпустите блокировку положительного давления. Ячейка начнет образовывать уплотнение, а сопротивление увеличится выше 1 ГОм. В зажиме напряжения удерживайте элемент на -68 мВ.
   5. Слегка оттяните камеру по диагонали, чтобы снять избыточное давление с ячейки.
   6. Компенсируйте быструю и медленную емкость пипетки.
   7. Сделайте кратковременное отсасывание через трубку, соединенную с держателем пипетки, чтобы прорвать ячейку и получить цельную конфигурацию ячейки.
   8. Переключитесь в режим Cell в окне тестирования мембраны в программном обеспечении для сбора и анализа данных электрофизиологии (например, Clampex).
   9. Перед каждой записью клещей напряжения проведите испытание мембраны с помощью того же программного обеспечения и запишите соответствующие параметры в лабораторный журнал (сопротивление мембраны, сопротивление доступа и емкость).
   10. Для последующих экспериментов поддерживайте температуру регистрирующей ванны на уровне 27–30 °C и скорость потока на уровне 1,5–2,0 мл/мин.

Таблица 1: Состав различных решений.

	Концентрации раствора (мМ)
	разрезание на ломтики	Нормальный аКСФ	Низкий уровеньCa2+ aCSF	Sr+ aCSF	Пипетка/внутренняя
NaCl	87	126	126	126	- T
KCl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0,5	2.5	0,5	- T	- T
СрКл2	- T	- T	- T	2.5	- T
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	2
2PO4	1.25	1.25	1.25	1.25	- T
НаОГС3	25	26	26	26	- T
глюкоза	25	10	10	10	- T
сахароза	75	- T	- T	- T	- T
К-глюконат	- T	- T	- T	- T	116
Na-глюконат	- T	- T	- T	- T	12
ХЕПЕС	- T	- T	- T	- T	10
К 2-ЭГТА	- T	- T	- T	- T	1
К2АТФ	- T	- T	- T	- T	4
Д/о3ГТП	- T	- T	- T	- T	0,3

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл шприц	БД	309659
Лезвие 10	Fisher Scientific/другие	No 35698 (Английский
Лезвие 22	VWR / другие	21909-626
Шприцевые фильтры 22 мкМ	Милипоре	Тел.: 09-719-000
Адсон форцепс	Инструменты Гарварда	72-8547 (Английский
Острые ножницы под углом	Инструменты Гарварда	72-8437 (Английский)
Зажим	Молекулярные приборы	Зажим pClamp 10
Двухлезвийное лезвие	ВВР	74-0002 (Английский
фильтровальная бумага	Сигма/другие	1001090
Тонкая кисть	Рыбак/разное	15-183-35/разное
Газодисперсионная трубка	ВВР	ЛГ-8680-120
Изофлуран	Фрезениус Каби/другие	М60303
Клей Крейзи	различный	различный
Мини-анализ	Синаптософт	МиниАнализ 6
Осмомотер	Вескор Инк	Модель 5600
Парафильм	сигма	ПМ-996
Пастеровская пипетка	ВВР	14672-200
pH-метр	Mettler Toledo	FE20-ATC
Резиновая груша	ВВР	82024-550
Рукоятка скальпеля No3	Инструменты Гарварда	72-8350 (Английский)
Рукоятка скальпеля No4	Инструменты Гарварда	72-8356 (Английский)
Лезвие с одной кромкой	ВВР	55411-050
Вибратомный слайсер	Лейка	VT1200S
Система очистки воды	Многородность	Milli-Q Академический А10
Крышка колодезной пластины	Рыбак/разное	07-201-590/разное
CaCl2 2H2O	сигма	С7902
CdCl2	сигма	202908
ЭГТА	сигма	Е3889
глюкоза	сигма	Г5767
ХЕПЕС	сигма	Н3375
К2-АТФ	сигма	А8937
KCl	сигма	П9333
К-глюконат	сигма	Г4500
MgCl2 6H2O	сигма	М2670
Вода класса молекулярной биологии	сигма	В4502-1Л
Na3GTP	сигма	Г8877
NaCl	Биошоп	СОД001.1
Na-глюконат	сигма	С2054
НаН2ПО4	сигма	71504
NaHCO3	сигма	С6014
Пикротоксин	сигма	П1675
СрКл	сигма	255521
сахароза	Биошоп	СУК507.1

) гг. ) )