Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Генерация плазмид pHuC_Mermaid
ПРИМЕЧАНИЕ: Mermaid - это биосенсор, разработанный путем сопряжения потенциал-чувствительного домена (VSD) датчика напряжения Ciona intestinalis (теперь Ciona robusta), содержащего фосфатазу (Ci-VSP), с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET) флуорофорами Umi-Kinoko Green (mUKG: донор) и мономерной версией излучающего апельсин флуоресцентного белка Kusabira Orange (mKOk: акцептор). Для данного биосенсора конформационные изменения домена VSD, индуцированные деполяризацией мембраны, увеличивают близость донорных и акцепторных флуоресцентных белков, тем самым увеличивая передачу энергии между ними (увеличивая коэффициент FRET). ПДМ обеспечивает эффективную локализацию биосенсора на плазматической мембране. Нейронная экспрессия биосенсора (в спинном мозге сигнал обнаруживается как в интернейронах, так и в моторных нейронах) достигается путем клонирования открытой рамки считывания (ORF) «Русалки» под пан-нейронным промотором HuC рыбки данио.
- Амплифицируйте методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) открытую рамку считывания (ORF) Mermaid из плазмиды pCS4+ Mermaid с ДНК-полимеразой Pfu (корректура) с использованием праймера T3 Universal и праймера Mermaid SmaI (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) с целью вставки сайта рестрикции SmaI перед ORF Mermaid.
- Используют следующую смесь для ПЦР: 0,5 мкл полимеразы Pfu DNA, 7,5 мкл специфического 10-кратного буфера, 1 мкл 10 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 2,5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 0,5 мкл (50 нг) плазмидного препарата и 1 мкл 20-мкм стоковых растворов каждого праймера в общем объеме 50 мкл.
- Нагрейте смесь для ПЦР в течение 15 с при 95 °C, загрунтуйте ее в течение 15 с при 50 °C и удлините в течение 4 минут при 72 °C в общей сложности на 35 циклов.
- Очистите гелем конкретный продукт тупой ПЦР с помощью коммерческого набора для очистки гелем, следуя протоколу производителя.
- Клонируйте фрагмент ДНК в тупой вектор pCMV-SC в соответствии с протоколом производителя.
- Линеаризируйте русалочно-положительную плазмиду (названную pCMV-SC_Mermaid) ферментом рестрикции SmaI для последующего введения промотора HuC.
- Реакцию рестрикции настраивают следующим образом: 0,5 мкл (10 ЕД) фермента рестрикции SmaI, 2 мкл буфера набора 10x и 5 мкг плазмидной ДНК в общем объеме 20 мкл. Инкубируют реакцию при 25 °С в течение 1 ч.
- Очистите расщепленную плазмиду гелем с помощью коммерческого набора для очистки гелем в соответствии с протоколом производителя.
- ПЦР-амплифицируйте промотор HuC (pHuC) с ДНК-полимеразой Pfu и геномной ДНК данио-рерио в качестве матрицы, используя пару HuC-специфичных праймеров (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAAGGGTCCA и HuCprom-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) и охватывая область 3150.о. выше ATG.
- Смесь для ПЦР проводят по следующей схеме: 0,5 мкл полимеразы ДНК ПФУ, 7,5 мкл специфического 10-кратного буфера, 1 мкл 10 мМ дНТФ, 2,5 мкл ДМСО, 200 нг геномной ДНК и 1 мкл 20-мкм стоковых растворов каждого праймера в общем объеме 50 мкл.
- После начального этапа в 2 минуты при 95 °C нагрейте смесь для ПЦР в течение 15 с при 95 °C, загрунтуйте ее в течение 15 с при 50 °C и удлините в течение 4 минут при 72 °C в общей сложности на 35 циклов.
- Очистите гель конкретного продукта тупой ПЦР с помощью коммерческого набора для очистки гелем в соответствии с протоколом производителя.
- Лигатируют эквимолярное количество очищенного pCMV-SC_Mermaid (стадия 1.5) и ДНК pHuC (стадия 1.7) с использованием 1 мкл Т4-ДНК-лигазы и 1 мкл специфического 10X-буфера в общем объеме 10 мкл. Инкубируют реакцию в течение 16 ч при 4 °С.
- Трансформируйте аликвоту компетентных клеток с 5 мкл реакции лигирования (шаг 1.8) в соответствии с инструкциями производителя.
- Выберите pHuC-положительные клоны (pHuC_Mermaid) с промотором, вставленным в соответствующей ориентации с помощью двойного разложения Sal I-EcoRV (сайт рестрикции SalI был введен выше по потоку фрагмента промотора на стадии 1.6, в то время как сайт рестрикции EcoRV расположен ниже области полиаденилирования, PolyA, плазмиды pCMV-SC).
- Настройте рестрикцию следующим образом: 0,5 мкл (10 U) ферментов рестрикции SalI и EcoRV, 2 мкл буфера kit10X и 1 г pHuC_Mermaid ДНК в общем объеме 20 мкл. Инкубируйте реакцию при 37 °C в течение 1 ч. Запустите реакцию на агарозном геле.
2. Микроинъекция эмбриона
- Оплодотворенную икру, полученную от взрослых рыбок данио Wild-type (штамм AB) или Sod1-G93R, переложите в чашку Петри диаметром 10 мм с помощью пластиковой пипетки.
- Промойте эмбрионы в холодной (4 °C) рыбьей воде и немедленно введите их в желток с 200 пг pHuC_Mermaid плазмиды с помощью микроинъектора (для общего и подробного описания процедуры микроинъекции).
- С помощью пластиковой пипетки перенесите эмбрионы в чашку Петри и инкубируйте их в рыбьей воде при температуре 28 °C до тех пор, пока они не достигнут желаемой стадии развития (через 20-24 часа после оплодотворения, hpf) для проведения следующих анализов.
3. Анализ спонтанного скручивания хвоста
ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените поведение спонтанного скручивания хвоста у 20-24 эмбрионов HPF с препаратом рилузолом или без него.
- Перенесите эмбрион в круглую чашку Петри диаметром 90 мм, наполненную рыбьей водой, содержащей 0,2% ДМСО (рилузол кортикул), и вручную дехорионате с помощью двух ювелирных щипцов с острыми кончиками. Инкубируйте эмбрион в течение 5 минут.
- Обнаружение скручивания хвоста при комнатной температуре (RT) во время видеосъемки в течение 1 минуты с помощью цифровой камеры, установленной на стереомикроскопе. Получение временных рядов с временным разрешением 30 кадров/с.
- Рассчитайте частоту спонтанных скручиваний хвоста, подсчитав количество изгибов (как контралатеральных, так и ипсилатеральных) в единицу времени.
- Чтобы оценить действие препарата рилузол, аккуратно с помощью пластиковой пастеровской пипетки перенесите эмбрион в новую 90 мм чашку Петри, наполненную рыбьей водой, содержащей 5 мкМ рилузола.
- Инкубируйте эмбрион в течение 5 минут, прежде чем записывать видео продолжительностью 1 минуту и выполнять поведенческий анализ, как описано выше.
4. Настройка визуализации для визуализации биосенсора русалки у живых эмбрионов: одновременное обнаружение сигналов донора и акцептора
- Поместите 20 - 24 эмбрионов hpf в 1% агарозу с низкой температурой плавления в рыбью воду при температуре 37 °C в 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном. Расположите эмбрионы на боку. Подождите, пока агароза застынет при комнатной температуре.
- Перенесите чашку для визуализации на столик инвертированного конфокального объектива, установленного на инвертированном микроскопе. Идентификация моторных нейронов, экспрессирующих биосенсор с помощью объектива 20X (числовая апертура 0,7, NA), путем возбуждения mUKG линией аргонового лазера с длиной волны 488 нм и регистрации его излучения в диапазоне от 495 до 525 нм.
- Для измерения FRET возбудите mUKG, донора пары FRET, с помощью лазерной линии с длиной волны 488 нм. Одновременное детектирование с помощью резонансного сканера, работающего с частотой 8 000 Гц в двунаправленном режиме, флуоресценции, излучаемой донором (между 495 и 525 нм), и флуоресценции, излучаемой акцептором mKOk (между 550 и 650 нм, канал FRET). Если возможно, используйте лазер с длиной волны 473 нм.
заметка: Эффективность возбуждения донора будет немного снижена (85% вместо 93% при 488 нм), но также уменьшится перекрестное возбуждение акцептора (с 17% при 488 нм до 9% при 473 нм лазерной линии).
- Чтобы снизить фототоксичность и обесцвечивание флуорофорами, сведите к минимуму освещенность образца за счет уменьшения мощности лазерной линии (в окне траектории луча программного обеспечения для сбора данных).
- Оптимизируйте возбуждение в соответствии с параметрами усиления и смещения, которые были установлены в начале эксперимента и оставались постоянными на протяжении всего сеанса. Чтобы задать смещение, измените цвет изображения на значения интенсивности (с помощью таблицы преобразования Q) и во время сканирования с выключенным лазером поверните ручку смещения (интеллектуальное смещение) так, чтобы пиксели фона имели интенсивность немного выше нуля. С помощью той же таблицы поиска, включив лазер во время сканирования, поверните ручку усиления (интеллектуальное усиление), чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум, стараясь избегать насыщенных пикселей.
- Используя открытое отверстие (2 воздушных блока), получите 16-битные изображения, чтобы обеспечить достаточный динамический диапазон для количественного анализа. Избегайте усреднения, чтобы увеличить скорость сбора данных и свести к минимуму фотообесцвечивание.
- В окне получения программного обеспечения выберите размер поля изображения 512 x 64 пикселей (размер пикселя: 605 нм) из раскрывающегося меню.
- В окне режима сбора данных выберите xyt (замедленная съемка в одной плоскости xy) враскрывающемся меню и запишите изменения напряжения спинномозговых нейронов эмбриона путем захвата одной плоскости xy, установив параметры сбора данных для записи одного изображения каждые 30 мс в течение 1 минуты.
- Чтобы оценить влияние введения рилузола на деполяризацию мембраны в том же нейроне, приобретите новый набор данных через 5 мин после добавления рыбьей воды, содержащей 5 мкМ рилузола.
- Для анализа FRET используйте макро Biosensor_FRET ImageJ (экспрессирующий одноцепочечные биосенсоры FRET).
- Оцените отношение FRET базальной мембраны каждого нейрона в точке t1 как ((среднее FRET - фон FRET)/(среднее значение донора - фон донора)), где FRET и средняя интенсивность донора - это средняя интенсивность флуоресценции, рассчитанная в той же области интереса (ROI), проведенной вокруг клетки для каждого приобретенного канала, а FRET и фон донора - это средняя интенсивность флуоресценции, рассчитанная в ROI поля зрения без флуоресцентного образца.
заметка: С подробным пошаговым описанием использования плагина можно ознакомиться на сайте www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
- Используйте программное обеспечение для построения графиков для сравнения частоты, амплитуды и продолжительности деполяризации между различными экспериментальными парадигмами. Сравните две группы с помощью непарного t-критерия Стьюдента и рассмотрите средние значения как статистически различные, когда P <0,05.
