$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка животных и анестезия
- Вызвать анестезию у мышей с помощью ингаляции изофлурана/кислорода. Используйте 4% изофлурана для индукции анестезии и 2-3% для поддержания потока кислорода при 2,5 л/мин. Корректируйте процентное содержание изофлурана для поддержания анестезии в соответствии с состоянием мыши, т.е. маленьким и слабым мышам требуется меньше анестетиков. Подтвердите адекватную анестезию, например, слегка надавливая на подушечку для ходьбы задних конечностей, чтобы проверить отсутствие рефлекса отмены боли.
- Контролируйте температуру тела мыши с помощью термостатической нагревательной пластины при температуре 37 °C, чтобы предотвратить снижение температуры тела во время анестезии.
- Установите мышь с носовым конусом для поддержания анестезии. Убедитесь, что животное получает достаточное количество кислорода, убедившись, что носовой конус не блокирует дыхательные пути и что животное дышит ровно.
- Во время записи следите за тем, достаточно ли мышь обезболивается, наблюдая за частотой дыхания (примерно 1 Гц в анестезии) и отсутствием рефлекса отмены при умеренном давлении. Увеличивайте концентрацию изофлурана вручную, если анестезия недостаточно глубокая.
- После измерений оставьте мышь восстанавливаться на нагревательной пластине или в тепле инфракрасной лампы до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения грудины, примерно на 2-5 минут. Не оставляйте мышь без присмотра и в компании других мышей до тех пор, пока она полностью не оправится от наркоза.
2. Измерение CMAP в передних конечностях
- Используйте игольчатые электроды 27 G для измерения CMAP передних конечностей. Рекомендуемые места расположения электродов приведены на рисунке 1.
- Расположите электроды на передние конечности следующим образом.
- Расположите мышь на грелке в положении лежа на спине и с помощью клейкой ленты удлините обе передние конечности по бокам тела (рис. 1B).
- Поместите стимулирующие электроды (1 = анод и 2 = катод) подкожно с обеих сторон передней конечности так, чтобы они совпали с нервом плечевого сплетения. Приподнимите кожу, чтобы ввести иглу перпендикулярно коже и протолкните иглу примерно на 5 мм под кожу, не прокалывая нижележащие мышцы.
- Поместите записывающий электрод (3) подкожно поверх двуглавой мышцы плеча, приподнимая кожу. Поместите электрод сравнения (4) на прогулочные площадки на глубину 3 мм под углом 30 градусов. Поместите заземляющий электрод (5) подкожно на боковую сторону мыши.
заметка: В этой конфигурации электроды находятся в непосредственной близости друг от друга. Не допускайте соприкосновения электродов друг с другом, так как это искажает запись.
3. Сбор данных
- Начните стимуляцию, нажав кнопку рекуррентного стимула в блоке контроллера, и поверните ручку регулятора интенсивности, чтобы увеличить стимул. Стимулируйте все аксоны с помощью 1 импульса/с с длительностью стимула 0,1 мс. Выберите правильную частоту и продолжительность из выпадающих меню в программном обеспечении.
- Для достижения супрамаксимальных стимулов (5-20 мА; в демиелинизирующих условиях до 60 мА) применяйте увеличивающие стимулы, поворачивая ручку регулятора интенсивности до тех пор, пока амплитуда ответа CMAP не перестанет увеличиваться. После этого увеличьте стимул еще на 20%, чтобы амплитуда CMAP достигла своего максимального отклика. Завершите стимуляцию, снова нажав кнопку повторного стимула.
- С помощью инструмента маркера укажите следующие моменты в записи: начало стимула, начало ответа, максимальный положительный пик и максимальный отрицательный пик (рис. 2).
- Определите латентность (в мс) как задержку от начала стимула до начала ответа (рис. 2). Определите начало реакции как самую раннюю точку, в которой амплитуда начинает увеличиваться. Используйте задержку для оценки демиелинизации в аксонах.
- Измерьте амплитуду (мВ) от максимального отрицательного до максимального положительного пика (Рисунок 2). Используйте величину амплитуды для корреляции количества функциональных аксонов.
