Электрофизиологическая регистрация реакций напряжения фоторецепторов сетчатки дрозофилы на световые стимулы

Аннотация

Источник: Juusola, M., et al. Электрофизиологический метод регистрации внутриклеточных реакций фоторецепторов и интернейронов дрозофилы на световые стимулы in vivo. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео описывается протокол электрофизиологической регистрации активности фоторецепторов в глазу иммобилизованной дрозофилы, позволяющий точно измерять изменения напряжения в ответ на световые стимулы.

Протокол

1. Запись с фоторецепторов R1-R6

1. Всегда будьте заземлены при работе с микроэлектродным усилителем (например, прикасаясь к металлической поверхности клетки Фарадея или антивибрационного стола), так как это предотвращает случайную подачу статического заряда на головной стол, который может повредить схему.
2. Освещайте столб платформы для подготовки мух сверху с помощью двух световодов на гусиной шее (рис. 1A) (с источником холодного света внутри клетки Фарадея) так, чтобы держатель мухи можно было разместить на столбе в предпочтительном положении под тщательным визуальным контролем.
3. Установите держатель мухи (вместе с мухой в нем!) на стойку платформы для подготовки мух. Поверните держатель мухи так, чтобы левый глаз мухи был обращен прямо к исследователю (рисунок 1B).
4. Осторожно введите тупой электрод сравнения через глазки мухи в капсулу головы с помощью небольшого грубого микроманипулятора, наблюдая за препаратом через стереомикроскоп (рис. 1C). Не проталкивайте электрод слишком глубоко, так как это может повредить мозг мухи.
   1. В качестве альтернативы вставьте электрод сравнения в заднюю часть грудной клетки. Всегда следите за тем, чтобы муха выглядела здоровой (двигала своими усиками), а ее глаза были целы, не были случайно повреждены. Если препарат выглядит менее чем безукоризненно, подготовьте новую муху для экспериментов.
5. Введите острый записывающий микроэлектрод в левый глаз через небольшое отверстие, покрытое вазелином. Используйте большое увеличение в стереомикроскопе и перемещайте световоды и фокальную плоскость так, чтобы расположение кончика электрода стало очевидным в 3D по его отражательной способности.
   Примечание: На рисунке 1D показано, как должна быть расположена голова мухи (по отношению к углу, под которым регистрирующий микроэлектрод входит в глаз) для записи фоторецепторов. Загнать электрод в глаз, не сломав его, — самый сложный этап эксперимента. Если кончик электрода пропускает небольшое отверстие в глазу, попадая в роговицу, он обычно ломается.
6. Включите микроэлектродный усилитель, когда оба электрода плотно окажутся внутри препарата, в электрическом контакте с жидкостями организма мухи.
7. Выключите источник холодного света (внутри клетки Фарадея) и отключите его от сети. Подключите вилку к центральному заземлению, чтобы свести к минимуму электрический шум, вызванный контуром заземления, и отодвиньте световоды в виде гусиной шеи, чтобы систему Cardan-arm можно было свободно перемещать вокруг мухи. Выключите свет в комнате, чтобы убедиться, что подготовка к мухе теперь находится в относительной темноте.
8. Измерьте сопротивление записывающего электрода в глазу. Используйте только записывающие электроды с сопротивлением 100 - 250 МОм.<бр/> заметка: Добиться высококачественной внутриклеточной записи с помощью электрода <70 МОм практически невозможно. Если сопротивление составляет <80 МОм, вполне вероятно, что наконечник электрода сломался. В этом случае выключите усилитель и поменяйте записывающий электрод.
9. Установите усилитель в режим записи токовых клещей (CC) или мостового тока. Устраните любую произвольную разницу напряжений между записывающим и референсным электродами, так как оба теперь находятся в электрически связанном внеклеточном пространстве, установив смещение сигнала (записывающее напряжение) равным нулю. Следите за изменениями смещения сигнала с помощью показаний дисплея усилителя или экрана осциллографа.
10. Подождите 2-3 минуты, пока глаз мухи не потемнеет.
11. Введите наконечник записывающего электрода глубже в глаз с небольшими шагами от 0,1 до 1 микрона. Делайте это с помощью пьезостеппера по оси X микроманипулятора с дистанционным управлением или аккуратно вращая ручку с тонким разрешением ручного манипулятора.
12. Стимулируйте глаз мухи короткими (1 - 10 мс) вспышками света по мере продвижения записывающего электрода в ткани.
    заметка: Если записывающий электрод расположен в сетчатке глаза и глаз функционирует нормально, каждая световая вспышка будет вызывать кратковременное и небольшое падение напряжения (гиперполяризация 0,2 - 5 мВ), называемое электроретинограммой (ЭРГ). Это изменение полевого потенциала внеклеточного пространства вызвано коллективной реакцией клеток сетчатки на свет.

Результаты

Рисунок 1. Позиционирование держателя мухи и электродов для проведения экспериментов. (А-Б) Держатель для мух размещается на записывающей платформе, которая также обеспечивает контроль температуры с помощью элемента Пельтье (A: белая круглая платформа в центре). Кронштейн Cardan-arm позволяет точно расположить световой стимул на равном расстоянии (с помощью x,y-вращения) вокруг мухи, при этом источни...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стерео зум-микроскоп для подготовки мухи	Олимп	Окуляры SZX12 DFPLFL1,6x PF: WHN30x-H/22	Способен к ~150-кратному увеличению с большим рабочим расстоянием; сделанная на заказ тяжелая стальная настольная подставка
Стереомикроскоп во внутриклеточной установке	· Олимп	Olympus SZX7; окуляры: WHN30x-H/22	30-кратные окуляры необходимы для того, чтобы хорошо видеть отражения кончика электрода при прохождении его через маленькое отверстие роговицы в глаз
Микроскоп Nikon	Nikon SMZ645; окуляры: C- W30x/7
Антивибрационный стол	Меллес Гриот	С метрическими отверстиями M6 на макетной плате	Наши изготовленные на заказ оснастки имеют большое отверстие, просверленное в толстой макетной плате, которое пропускает снизу столб платформы для подготовки к мухе (в котором находится медный радиатор с электроникой)
Ньюпорт
Микроманипуляторы	Нарисигэ	Нарисигэ НМН-21	В наших внутриклеточных установках используются различные системы микроманипуляторов для ввода записывающих электродов shap в глаз мухи. Все перечисленные манипуляторы успешно обеспечивают длительную стабильную запись от фоторецепторов и БМО дрозофилы.
Хаксли Бертрам	Ось Huxley xyz с точным ручным управлением
Sensapex	Тройная ось Sensapex
Марцхойзер	Märzhäuser DC-3K с дополнительным пьезошаговым двигателем по оси X и контроллером MS 314
Магнитные подставки	Подойдет любое магнитное основание с переключателем включения/выключения		Например, для управления кабелями внутри клетки Фарадея
Держатели электродов	Гарвардский аппарат	ESP/W-F10N
Серебряная проволока	Мировые прецизионные приборы	AGW1510	0,3 - 0,5 мм в диаметре; необходимо хлорировать для держателей электродов
Волоконно-оптический источник света	Много разных, в том числе и Olympus
Оптоволоконные пучки	Технология UltraFine		Для подачи светодиодного светового стимула на систему карданного рычага. Мы используем как жидкие, так и кварцевые световоды (диапазон от УФ до ИК)
Лаборатория Торна
Трубка для катинга от мух		P80-50P 50мл цент. туба PP., упаковка 100 шт	Отрежьте коническое дно от пластиковой центрифужной пробирки объемом 50 мл и приклейте на нее наконечник пипетки объемом 1 мл.
Цифровая система сбора данных	Национальные инструменты
Одноэлектродный усилитель тока/напряжения с зажимом и микроэлектродом	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ продукты/усилители/сек-одиночные- electrode-clamp/sec-10lx.html	Выдающийся исполнитель!
Головная сцена	Стандарт (+/- 150 нА)	Для npi SEC-10LX
Светодиодные источники света и драйверы	2-канальный OptoLED (Cairn Research Ltd., Великобритания)		Многие из наших систем стимулирования созданы собственными
Самостоятельно спроектированный и сконструированный
Программное обеспечение для сбора и анализа	Множество компаний на выбор		Biosyst; специально написанная система на базе Matlab для экспериментальной и теоретической работы в лаборатории Juusola
Персональный компьютер или Mac			Убедитесь, что ПК или Mac совместим с системой сбора данных и программным обеспечением
Система карданных рычагов	Самостоятельно спроектированный и сконструированный		Обеспечение точного позиционирования световых стимулов по осям x, y, z
Система контроля температуры Пельтье	Самостоятельно спроектированный и сконструированный
Клетка Фарадея	Самостоятельное изготовление		Электромагнитное шумозащитное экранирование
Нитевидные капилляры из боросиликатного стекла		Внешний диаметр: 1 mm
Внутренний диаметр: 0,5 - 0,7 мм
Капилляры из кварцевого стекла с нитью накаливания		Внешний диаметр: 1 mm
Внутренний диаметр: 0,5 - 0,7 мм
Съемник пипеток	Компания «Саттер Инструмент»	Модель P-2000 Лазерный съемник для микропипеток	Для боросиликатных электродов сравнения используйте предустановленную программу #11 (накладные электроды): Тепло = 350; Нить накала = 4; Скорость 36; Задержка = 200).1.2.1). Для боросиликатных записывающих электродов используйте предустановленную программу #12 (обычно она вытягивает хорошие обычные шарпы для фоторецепторной записи): Heat = 355; Нить накала = 4; Скорость 50; Задержка = 225; Тяга = 150. Для записи БМО, для которых требуются электроды с более тонкими наконечниками, эти значения необходимо регулировать. Для вытягивания кварцевых капилляров в мануале P-2000 предлагаются программы для<бр/> микроэлектроды с тонкими наконечниками. Эти предустановленные параметры служат полезными отправными точками для систематических модификаций для генерации электродов с хорошей успешностью проникновения и низким уровнем шума записи.
Внеклеточный Ringer Solution для электрода сравнения	Химикаты от Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, сахароза	Смотрите рецепт в разделе протокола
3 М раствор KCl для наполнения нитевидного записывающего микроэлектрода	Соли от Fisher Scientific	10010310, KCl
вазелин	Вазелин

силами данных