Мониторинг электрических сигналов от афферентных нейронов у обездвиженной личинки данио-рерио

Аннотация

Источник: Lunsford, E. T., et al. Активность афферентных нейронов задней боковой линии во время плавания у рыбок данио. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует запись электрических сигналов от афферентных нейронов у парализованной личинки данио-рерио путем расположения микропипетки рядом с ганглием боковой линии и формирования свободного уплотнения для захвата сигнала. Внеклеточный раствор поддерживает жизнеспособность нейронов во время этого процесса.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка материалов для электрофизиологической регистрации

1. Сделайте чашку для записи с силиконовым эластомером на дне.
   1. Нанесите тонкий слой самосмешивающихся компонентов силиконового эластомера (например, Sylgard) в чашку для культуры тканей со стеклянным дном до уровня края неглубокого колодца. Достаточно примерно 0,5 мл.
   2. Накройте крышкой и высушите блюдо не менее 48 часов при комнатной температуре.
2. Сделайте булавки для препарирования.
   1. С помощью источника питания постоянного тока подайте отрицательный заряд (5 В) на стакан из травителя объемом 100 мл (3M KOH) и прикрепите вольфрамовую проволоку (0,002 дюйма; диаметр 50,8 мкм) к положительно заряженному выходу.
      осторожность: Отрицательные и положительные провода не должны соприкасаться друг с другом во время этой процедуры, так как вы можете подвергнуться риску образования искр, которые могут представлять потенциальную опасность возгорания.
   2. Протравите вольфрамовую проволоку, быстро и многократно опуская наконечник в ванну для травления, пока наконечник не сузится до острого конца. Под стереомикроскопом отрежьте проволоку примерно в 1 мм от кончика лезвием бритвы с прямым лезвием. Повторите еще три раза, а затем вставьте булавки в отвержденную записывающую чашку с помощью тонких щипцов.
3. Подготовьте записывающие электроды.
   1. С помощью горизонтального съемника микропипетки с коробчатой нитью накала протяните капиллярную трубку из боросиликатного стекла (внутренний диаметр: 0,86 мм, внешний диаметр: 1,50 мм) в электроды с наконечником диаметром 30 мкм с небольшой конусностью (рис. 1 Ai), которые будут использоваться для регистрации афферентных нейронов от задней боковой линии.
   2. Втяните дополнительную капиллярную трубку из боросиликатного стекла в пару электродов с меньшим диаметром наконечника (1-5 мкм). Держа по одному электроду в каждой руке, осторожно проведите кончиками друг по другу, чтобы сломать их под углом ~30°. С помощью микрокузницы отполируйте скошенный кончик до гладкости.
4. Создание протокола в программах записи электрофизиологии.
   1. Убедитесь, что правый головной столик подключен к входу канала 1 в задней части микроэлектродного усилителя тока и напряжения для записи афферентных нейронов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютерные спецификации усилителя токоизмерительных клещей минимально требуют процессора с частотой 1 ГГц или выше, Windows XP Pro или Mac OS X 10.46.6, привода CD-ROM с 512 МБ ОЗУ, 500 МБ свободного места на жестком диске и 2 USB-порта.
   2. Откройте программное обеспечение усилителя, управляемого компьютером.
   3. Установите канал 1 в режим токового зажима, нажав кнопку IC.
   4. Введите следующий параметр на вкладке I-Clamp 1. Первичный выход: 100x Потенциал мембраны переменного тока (100 000 мВ/мВ), Усиление: 1 000, Бессель: 1 кГц, Переменный ток: 300 Гц, Область: Байпас. Вторичный выход: 100-кратный потенциал мембраны переменного тока (100 мВ/мВ), усиление: 1, фильтр нижних частот: 10 Гц.
   5. Сохраните параметр channel как Ch1_Aff.
   6. Установите и откройте программное обеспечение для электрофизиологии патч-зажима.
   7. Нажмите «Настроить» и выберите «Лабораторный стенд», чтобы настроить аналоговые сигналы, добавив Ch1_Aff в каналы дигитайзера (например, Analog IN #0 и Analog IN #1), подключенные коаксиальным кабелем BNC к соответствующим масштабируемым выходам усилителя Channel 1. Нажмите на OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальные требования к компьютеру для дигитайзера: процессор с частотой 1 ГГц или выше, Windows XP Pro или Mac OS X 10.46.6, привод CD-ROM 512 МБ ОЗУ, 500 МБ свободного места на жестком диске и 2 порта USB.
   8. Нажмите «Получить» и выберите «Новый протокол».
   9. На вкладке Mode/Rate (Режим/Скорость) выберите Gap Free (Без разрывов); в разделе Acquisition Mode (Acquisition Mode) (Acquisition Mode) (Trial Length) (Use available disk space (т. е. записывать до остановки) (Use available disk space (т. е. записывать до остановки) или Desired Duration (чч:мм:сс), а затем установите значение Частота дискретизации на сигнал (Гц) равным 20 000 для максимального разрешения.
   10. На вкладке Входы выберите ранее настроенные аналоговые входные каналы (на шаге 1.4.6) и выберите Ch1_Aff для соответствующего канала.
   11. На вкладке Выходы выберите Cmd 0 и Cmd 1 для Channel #0 и Channel #1 соответственно.
       1. Подключите команду Channel 1 на усилителе к аналоговому выходу 0 на дигитайзере через коаксиальный кабель BNC.
   12. Остальные вкладки могут оставаться с настройками по умолчанию. Нажмите OK и сохраните протокол.

2. Приготовление раствора

1. Готовят раствор Хэнка: 137 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 0,25 мМ Na₂HPO₄, 0,44 мМ KH₂PO₄, 1,3 мМ CaCl₂, 1,0 мМ MgSO₄, 4,2 мМ NaHCO₄; pH 7,3. Разбавьте до 10% раствор Ганка, добавив в запас соответствующий объем деионизированной воды.
2. Приготовьте внеклеточный раствор: 134 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 1,2 мМ MgCl2, 2,1 мМ CaCl ₂, 10 мМ глюкозы и 10 мМ буфер HEPES, рН 7,8 скорректированный с помощью NaOH. Вакуумный раствор отфильтровать внеклеточный раствор через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
3. Приготовьте α-бунгаротоксин: Растворите 1 мг лиофилизированного α-бунгаротоксина в 10 мл внеклеточного раствора для получения 0,1% разведения.
4. Приготовьте раствор для эвтаназии: 50% (мг/л) буферизованный фармацевтический MS-222 в 10% растворе Хэнка.
   ВНИМАНИЕ: α-бунгаротоксин является мощным нейротоксином, который парализует мышцы, блокируя холинергические рецепторы. Необходимы перчатки и рекомендуется защита глаз во время работы с парализованным.

3. Подготовка личинок к электрофизиологической регистрации

1. Обездвижите личинок данио-рерио.
   1. Используйте личинки из выращенной в лаборатории популяции данио-рерио (Danio rerio; через 4-7 дней после оплодотворения) и поместите в раствор эмбриона (10% раствор Хэнка) при температуре 27 °C.
   2. С помощью переводной пипетки с большим наконечником перенесите личинку из корпуса в маленькую чашку Петри (35 мм) и удалите как можно больше окружающего раствора.
      заметка: Удаление раствора эмбриона предотвращает разведение паралитика и повышает его эффективность. Уголок салфетки можно использовать для отвода остатков раствора эмбриона, при этом крайне важно не контактировать с личинками и не оставлять их на воздухе.
   3. Погрузите личинки в 10 μл 0,1% α-бунгаротоксина примерно на 5 мин.<бр/> заметка: Время, необходимое для обездвиживания личинок, варьируется в зависимости от подготовки. Здоровый препарат зависит от тщательного контроля за устойчивым быстрым кровотоком и снижением двигательных реакций. Кратковременное чрезмерное воздействие паралитика может привести к медленному ухудшению общего состояния препарата, даже после тщательного вымывания. Лучше всего наносить промывку до того, как личинка будет полностью обездвижена, пока она еще проявляет признаки тонких мышечных вибраций.
   4. Парализованную личинку промыть внеклеточным раствором и принять ванну в течение 10 мин.<бр/> заметка: Вымывание позволяет личинке перейти от тонких мышечных колебаний к полному параличу. Кроме того, α-бунгаротоксин является антагонистом α9-субъединицы никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR), которая является критическим компонентом эндогенной цепи обратной связи, наблюдаемой этим протоколом; тем не менее, было показано, что этот эффект обратим в волосковых клетках Xenopus и данио-рерио после 10-минутного смывания.
2. Закрепите рыбу в записывающей чашке.
   заметка: Анестезия (например, MS-222, Tricaine) не требуется при приготовлении личинок данио-рерио (4-7 dpf), так как она вредит здоровью животных. На самом деле, личинки данио-рерио освобождены от определенных протоколов по позвоночным.
   1. С помощью переводной пипетки переместите личинку из ванны с внеклеточным раствором в записывающую чашку с силиконовым дном. Заполните оставшуюся часть чашки внеклеточным раствором.
   2. Под стереомикроскопом аккуратно расположите личинки с помощью щипцов с тонкими наконечниками над центром силиконового коврика, боковой стороной вверх, при этом передний и задний концы тела проходят слева направо соответственно. Затем с помощью щипцов с тонким наконечником возьмите вытравленный штифт из силиконового коврика и вставьте штифт ортогонально силикону через дорсальную хорду личинок прямо дорсально к анальному отверстию. Вставьте второй штифт через хорду возле конца хвоста и вставьте третий штифт через хорду дорсальной части газового пузыря (рис. 1B).
      заметка: При введении штифтов важно нацеливаться на центр ширины хорды, чтобы предотвратить нарушение кровотока или повреждение окружающей мускулатуры. Хорда находится дорсально по отношению к нерву задней боковой линии, поэтому при правильном закреплении не ожидается повреждения сенсорных нейронов боковой линии. Вводите после первого контакта так, чтобы не потревожить окружающие ткани. В идеале диаметр штифта должен составлять менее половины ширины хорды, чтобы обеспечить чистое введение. Если контакты превышают эту ширину, повторяйте шаг 1.2 до тех пор, пока не будет достигнута желаемая ширина контакта. Если после укола кровоток замедляется, повторите шаг 1.3 с новым образцом.
   3. Введите четвертый штифт через глазную пузырьку, обеспечивая при этом небольшое вращение по направлению к переднему краю, когда штифт вставляется в инкапсулятор (Рисунок 1B). При незначительном вращении следите за тем, чтобы ткань между клейтрумом и глазным пузырем обнажила скопление афферентных сомат.
      заметка: Угловое введение четвертого штифта необходимо для обеспечения обнажения афферентного ганглия задней боковой линии, который в противном случае заблокирован большим глазным пузырьком.

4. Запись афферентных нейронов

1. Заполните афферентный регистрирующий электрод 30 мкл внеклеточного раствора, вставьте его в держатель пипетки с правой головкой (рис. 1B, C) и опустите его в раствор для чашки, оказывая положительное давление (1-2 мм рт.ст.), создаваемое пневматическим преобразователем.
2. Найдите и свободно прикрепите к задней боковой линии афферентный ганглий.
   1. С помощью микроманипулятора опустите афферентный кончик электрода до тех пор, пока он не окажется над клейтрумом.
   2. Увеличьте увеличение до 40-кратного погружения и найдите место пересечения задней боковой линии нерва и клейтрума. Проследите за нервом боковой линии спереди от клейтрума до места, где волокна иннервируют афферентный ганглий задней боковой линии, различимый по дискретному скоплению сомы (рис. 1F).
   3. Поднесите наконечник электрода к афферентному ганглию и опустите пипетку до тех пор, пока наконечник не соприкоснется с эпителием. Аккуратно маневрируйте электродом так, чтобы вся окружность кончика соприкасалась с афферентным ганглием.
   4. Подайте отрицательное давление (20-50 мм рт.ст.) с помощью пневматического преобразователя и удерживайте.
      заметка: Отрицательное давление, оказываемое на афферентный ганглий, является мягким. Увеличение отрицательного давления может улучшить соотношение сигнал/шум, но здоровье афферентных нейронов ухудшается при длительном агрессивном всасывании, что снижает вероятность успешной записи.
3. Запись активности афферентных нейронов.
   1. Левый головной каскад должен быть подключен к усилителю, который ретранслирует усиленный сигнал в дигитайзер, который выводит указанный сигнал в программное обеспечение электрофизиологии патч-клемпа, подлежащее контролю на соседнем компьютере.
   2. В pClamp10 нажмите кнопку «Воспроизвести» на панели инструментов для мониторинга афферентных нейронов.
   3. Убедитесь, что запись афферентных нейронов по всей клетке достигается после того, как спайки происходят спонтанно, примерно каждые 100-200 мс (рис. 1E).
   4. Постепенно увеличивайте давление электродов, регистрирующих афферентные нейроны, до атмосферного (0 мм рт.ст.) и удерживайте его до конца записи.

Результаты

Рисунок 1: Одновременная электрофизиологическая регистрация афферентного нейрона задней боковой линии и активности вентрального моторного корешка. (A). Пример афферентного (i) и вентрального моторного корешка (ii) с рассыпчатым пятном (i) и записывающих электродов. Масштабные линейки представляют собой 50 мкм. (B) Личинки данио-рерио...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стакан 100 мл	пирекс	1000	Сосуд для травления
10-кратный объектив для погружения в воду	Олимп	UMPLFLN10xW	Малое увеличение для позиционирования личинок и регистрирующего электрода
40-кратный объектив для погружения в воду	Олимп	LUMPLFLN40XW	Увеличенное увеличение для позиционного наконечника электрода и установки патч-зажима
Коаксиальные кабели BNC	ТорЛабс	2249-С-12	Подключение каналов усилителя и дигитайзера; требуется 4
Капилляры из боросиликатного стекла с нитью накаливания	Уорнер Инструментс	Г150Ф-3	Внутренний диаметр: 0,86, внешний диаметр: 1,50; капиллярное стекло используется для формирования записывающих электродов
компьютер	Н/Д	Н/Д	Любой компьютер должен работать
Источник питания постоянного тока	Тэнма	72-420	Используется для электрического травления рассекающих штифтов
Электрофизиологический дигитайзер	Axon Instruments, Молекулярные приборы	Аксон DigiData 1440А	Возможность сбора данных патч-клумпинга
волокно	Компания «Саттер Инструмент»	ФБ255Б	Коробчатая нить 2,5 мм, используемая в съемнике микропипеток
Тонкие щипцы	Инструменты для точной науки	Dumont #5 (0,05 x 0,02 мм) Артикул 11295-10	Используется для манипуляций с личинками и вставки штифтов
Микроскоп DIC с фиксированным столиком	Олимп	BX51WI	Микроскоп, используемый для визуализации и установления записей с помощью патч-клэмпа
Гибкий конический наконечник для дозатора	Научный центр Фишера	02-707-169 (Английский	Гибкие наконечники позволяют вставлять его в записывающий электрод для дозирования внеклеточного раствора на наконечнике
Флюоротарка	Уорлд Прецизионные Инструменты Инк.	ФД3510-100	Стеклянная крышка с дном для записи тарелки
КимВайп	КимТех	Номер 34155 (Английский	Рабочая салфетка используется для отвода лишней жидкости от личинок
Квик-Гард	Уорлд Прецизионные Инструменты Инк.	710172	Самосмешивающийся силгардовый эластомер
Микроэлектродный усилитель	Axon Instruments, Молекулярные приборы	MultiClamp 700B	Усилитель с патч-клещей для двухканальной записи
Микрокузница	Нарисигэ	Микрокузнечное горне MF-830	Для полировки записывающего электрода
Блок управления микроманипулятором	Сискию	MC1000-eR/T	4-осевой циферблатный координатор для управления микроманипулятором
Съемник микропипеток	Компания «Саттер Инструмент»	Пылающий/коричневый P-97	Для втягивания капиллярного стекла в записывающие электроды
Блок управления микроскопом	Сискию	MC1000e	Располагает микроскоп вокруг неподвижного предметного столика и подготовки
Моторизованный микроманипулятор	Сискию	МХ7600	Позиционирование головного каскада и прикрепленного записывающего электрода для записи с помощью патч-зажима
Пульт MultiClamp Commander	Молекулярные приборы	2.2.2	Можно скачать со страницы загрузки Axon MultiClamp 700B Commander
Оптический воздушный стол	Корпорация Ньюпорт	VH3036W-ОПТ	Макетный изоляционный стол для плавающего микроскопа и минимизации вибраций во время записи
pCLAMP	Молекулярные приборы	10.7.0	Доступно для скачивания со страницы загрузки программного обеспечения для сбора и анализа электрофизиологических данных Axon pCLAMP 10
Чашка Петри	сокол	35-3001	Используется для погружения личинок в паралитические состояния
Держатель для пипеток	Молекулярные приборы	1-ХЛ-У	Держите записывающий электрод и подключайтесь к сцене
Пневматический преобразователь	Биомедицинские инструменты Fluke	ДПМ1Б	Для контроля внутреннего давления регистрирующего электрода
едкое кали	Сигма-Олдрич	221473-25Г	Травитель для травления рассекающих штифтов
Силиконовые трубки	Тайгон	14-169-1А	Трубка для подключения пневматического преобразователя к держателю пипетки
Стереомикроскоп	Карл Цейсс	STEMI 2000-C	Используется для визуализации кончиков булавок и во время подготовки личинок
Лезвие бритвы с прямой кромкой	Канопус	Заказ от amazon.com	Перерезает вольфрамовую проволоку при изготовлении рассекающих штифтов
шприц	Бектон Дикинсон Компоани	309602	Заполнен внеклеточным раствором для введения в записывающие электроды
Трансферная пипетка	Сигма-Олдрич	Z135003-500 шт.	Одноразовая нестерильная пипетка для переноса личинок
Трикаин метансульфонат	Синдель	No 12854	Аптечный анестетик, применяемый для усыпления личинок с высокой дозировкой.
Вольфрамовая проволока	Уорлд Прецизионные Инструменты Инк.	715500	0,002 дюйма, диаметр 50,8 мкм; используется для изготовления рассекающих штифтов
Вакуумная фильтрационная установка	Сигма-Олдрич	SCGVU11RE	Одноразовые, стерильные, вакуумные фильтрующие установки, используемые для стерилизации внеклеточного раствора, используемого для электрофизиологического электродного звонаря
Напряжение-зажим, ток-зажим, головной каскад	Молекулярные приборы	CV-7B	Поставляется с усилителем MultiClamp 700B, используемым в качестве левого и правого напорных каскадов
α-бунгаротоксин	ТермоФишер	В1601	Для обездвиживания личинок перед регистрацией

) ) См.