$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Приготовление острых срезов мозга гиппокампа
- Приготовление растворов для срезов
- Приготовьте 500 мл раствора для резки сахарозы, состоящего из: 194 мМ сахарозы, 30 мМ NaCl, 4,5 мМ KCl, 10 мМ D-глюкозы, 1 мМ MgCl2, 1,2 мМ2PO4 и 26 мМ NaHCO3, 290-300 мОсм, насыщенного 95% O2 и 5% CO2.
- Приготовьте 1-2 литра записывающего раствора (искусственной спинномозговой жидкости, АКСН) в составе: 124 мМ NaCl, 4,5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ D-глюкозы, 2 мМ CaCl2, 1,2 мМ2PO4 и 26 мМ NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 (после барботирования), 290 - 300 мОсм, насыщенных 95% O2 и 5% CO2. Наполните стакан с камерой для держателя среза мозга раствором для записи и поддерживайте ее при температуре 32-34 °C. Заполните вибратомную камеру ледяной водой.
- Подготовка острого среза
- Глубоко обезболите мышь, поместив ее в баночку-колокольчик, предварительно заряженную 2-3 мл изофлурана. Проверьте рефлекс защемления пальца ноги и, если он не реагирует, быстро обезглавьте его с помощью острых ножниц или гильотины, как того требует ваш протокол для животных.
- Сделайте разрез 2-3 см с помощью ножниц от каудальной части черепа, чтобы разрезать волосистую часть головы по средней линии. Во время ручного втягивания волосистой части головы сделайте два горизонтальных разреза по 1 см от большого затылочного отверстия по бокам черепа. Затем с помощью тонких ножниц сделайте разрез по длине черепа, по средней линии от задней части черепа к носу.
- С помощью тонких щипцов, введенных вблизи средней линии, втяните разрезанный череп двумя частями. Извлеките мозг мыши из черепа и с помощью лезвия удалите мозжечок и обонятельные луковицы, которые расположены соответственно в каудальной и ростральной частях мозга. Их можно определить по большим трещинам, которые отделяют их от коры головного мозга.
- Установите мозговой блок на вибратомный лоток с помощью суперклея. Наполните вибратомный лоток раствором для холодной резки.
- Разрежьте срезы тканей в корональной плоскости толщиной 300 мкм. Обычно можно собрать 6 корональных срезов гиппокампа.
- После того, как каждая секция будет разрезана, немедленно переложите ломтики в стакан для срезов, нагретый до 32-34°C. Держите срезы при этой температуре в течение 20 минут, прежде чем снять стакан с секциями, и поместите его при комнатной температуре не менее чем на 20-30 минут до записи.
2. Измерение электрической динамики K+
- Настройка подготовки ломтика
- Аккуратно поместите срез мозга в ванну с помощью пастеровской пипетки и аккуратно удерживайте его на месте платиновой арфой с нейлоновыми струнами.
- Убедитесь, что кончики биполярного стимулирующего электрода параллельны друг другу и находятся на уровне плоскости среза. Медленно, в течение 6-7 секунд, вводите электроды в лучистый слой CA3 на глубину примерно 40-50 мкм для стимуляции коллатералей Шаффера. В корональных срезах CA3 может быть приблизительно идентифицирован как часть собственно гиппокампа латерально по отношению к гранулярному клеточному слою в гиппокампальной области, при этом лучевой слой попадает медиально и вентрально к пирамидальному клеточному слою.
- Осторожно введите К+-селективный электрод в лучистый слой CA1 на глубину примерно 50 мкм, медленно опуская электрод в течение примерно 3-4 секунд. Дайте потенциалу стабилизироваться на электроде, прежде чем применять стимуляцию к срезу: обычно это занимает от 5 до 10 минут. Если на срезе наблюдаются спонтанные изменения внеклеточного К+, то отбраковывайте и повторяйте этот процесс с новым срезом.
- Измерение вызванного К+ релиза
- Применяйте последовательности электростимуляции (8 импульсов), вручную нажимая на спусковой крючок на стимуляторе и записывая ответы в цифровом виде. Применяйте стимуляцию с частотой 10 Гц и длительностью импульса 1 мс, начиная с амплитуды стимула 10 мкА.
- Применяйте увеличивающую амплитуду стимуляции в 2 раза, пока не будет обнаружена максимальная амплитуда отклика K+. Если вы не видите никакой реакции, переместите электрод K+ ближе к месту стимуляции на 100 мкм с шагом
- Определите амплитуду стимула, которая вызывает половину максимальной реакции. По нашему опыту, она составляет от 40 до 160 мкА, в зависимости от качества препарата, возраста животного и расстояния между электродами стимуляции и селективным электродом K+.
- В том же срезе, используя амплитуду стимула на одну ступень ниже амплитуды, которая вызывает половину максимального отклика (например, если 80 мкА дает полумаксимальный отклик, используйте 40 мкА), применяют последовательности стимулов с возрастающим числом импульсов. Первоначально мы использовали последовательности из 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 импульсов.
- Чтобы подтвердить, что сигналы K+ опосредованы возбуждением потенциала действия электростимулированной коллатеральной ванны Шаффера, внесите 0,5 μМ тетродотоксина (TTX) в ACSF в течение 10 минут и повторите протокол стимуляции. Не следует наблюдать никаких вызванных реакций.
- После завершения эксперимента со срезом убедитесь, что электрод сохранил свою чувствительность, повторно откалибровав электрод в калибровочных растворах и убедившись, что реакция не отклонилась более чем на 10% от первоначальной калибровки