$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Записи от Q175 дикого типа (WT) и гетерозигот (HETs) могут быть выполнены в любом возрасте и поле. Здесь мы изучали мужчин и женщин в возрасте от 51 до 76 недель.
1. Инъекция глутаматного сенсора iGluu для экспрессии кортикостриатальных аксонов
- Используйте съемник пипеток (одноступенчатый режим) для подготовки пипеток из боросиликатного стекла к введению вируса. После вытягивания разбейте пипетку вручную, чтобы получить диаметр наконечника 30–50 мкм. В автоклаве пипетки работают и хирургические инструменты, в том числе бормашина для вскрытия черепа.
- Храните вирус AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x10 13ггц/мл) при -80 °C в 10 мкл аликвот. Если инъекции проводятся вскоре после выработки вируса (в течение 6 месяцев), поддерживайте при температуре 5 °C. Перед операцией выньте флакон и поддерживайте его при комнатной температуре.
- Наполните стеклянную пипетку и удалите пузырьки.
- Обезболивают животное внутрибрюшинным введением раствора, содержащего 87,5 мг/кг кетамина и 12,5 мг/кг ксилазина. Подкожно введите 0,25% бупивакаин (8 мг/кг) для дополнительного облегчения боли. Проверяйте глубину анестезии, контролируя мышечный тонус и наблюдая за отсутствием болевых рефлексов.
- Побрейте кожу на голове и простерилизуйте ее 70% спиртом. Поместите мышь в стереотаксическую рамку.
- Используйте скальпель, чтобы удалить кожу, и высокоскоростное (38 000 об/мин) сверло, чтобы сделать отверстие диаметром 1,2 мм в кости над моторной корой.
- Установите шприц с прикрепленной инъекционной пипеткой в держатель прецизионного манипулятора. Введите вертикально ориентированную пипетку в кору головного мозга в 4 разных местах. Координаты инъекции по отношению к брегме (в мм): передняя 1,5, боковая 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Глубина по отношению к твердой мозговой оболочке составляет (в мм): 1,5–1,7.
- Используя систему инъекций, введите 0,3 мкл на участок неразбавленного раствора вируса со скоростью 0,05 мкл/мин. После каждой инъекции оставляйте пипетку на месте в течение 1 минуты, прежде чем медленно извлекать ее (1 мм/мин).
- В завершение закройте операционную рану нейлоновым швом.
- Оставьте мышь на 0,5–1 час на грелке в чистой клетке, прежде чем вернуть ее в исходную клетку.
- Поддерживайте у мыши 12-часовой цикл день-ночь в течение 6-8 недель перед приготовлением острых срезов мозга.
заметка: Чтобы избежать иммунных реакций, приводящих к повреждению клеток и потере синапсов, введение нескольких вирусных конструкций необходимо проводить одновременно или в течение 2–3 часов после первичной инъекции. Координаты для инъекции iGluu были выбраны в соответствии с атласом мозга Паксиноса и Франклина. Они соответствуют моторной коре М1. Иммуноокрашивание инъецированного мозга визуализировало многочисленные, но в основном хорошо изолированные аксоны и варикозное расширение вен аксонов в ипси- и контралатеральном стриатуме, а также в контралатеральной коре M1 и S1.
2. Поиск глутаматергических терминалей, экспрессирующих глутаматный сенсор iGluu
- Режим калибровки
- Подготовьте камеру sCMOS и программное обеспечение для управления камерой со следующими настройками. На странице Считывание установите Скорость считывания пикселей: 560 МГц (= самое быстрое считывание), Чувствительность/Динамический диапазон: бит, Фильтр паразитных шумов: Да, Перекрывающееся считывание: Да. На странице Группирование/ROI выберите Во весь экран.
- Приготовьте предметное стекло, содержащее каплю 5 мг/мл Lucifer Yellow (LY) под покровным листом.
- Поместите предметное стекло LY под объектив с 63-кратным увеличением, откройте лазерный затвор и выполните серийный захват с использованием следующих настроек: Объединение пикселей: 1x1, Режим запуска: Внутренний, Время экспозиции: Минимальное (подлежит определению).
- Отрегулируйте мощность лазера так, чтобы получилось флуоресцентное пятно диаметром 4 мкм (изображение не должно содержать насыщенных пикселей).
- Чтобы выполнить калибровку системы лазерного позиционирования, выберите следующие настройки в программном обеспечении для лазерного позиционирования: Диаметр пятна: 10, Скорость сканирования: 43 200 кГц. Нажмите кнопку «Начать получение изображения» на правой панели. Задайте Прогоны: 0, Задержка выполнения: 0 и выберите параметр Прогон с TTL на странице Последовательность. Нажмите кнопку «Калибровка» на странице «Калибровка» и откалибруйте программное обеспечение для управления лазером в соответствии с инструкциями, показанными в верхнем левом углу экрана сбора данных.
- Если в настройке используется независимое программное обеспечение для управления камерой и лазером, получите скриншоты из окна захвата камеры и отправьте их в программное обеспечение для управления лазером для повторного расчета координат XY. Если программное обеспечение установлено на разных компьютерах, то используйте видеограббер для импорта изображения в программное обеспечение для управления лазером. Программному обеспечению для управления лазером потребуется информация о коэффициентах масштабирования и смещениях XY. Для этого определите координаты верхних левых, нижних левых и нижних правых углов изображения в окне сбора данных программы лазерного управления. Рассчитайте коэффициенты масштабирования по следующим формулам: Коэффициент X = (X снизу-справа – X снизу-слева)/2048, Смещение X = X снизу-влево, Y-фактор = (Y верхний-левый – Y нижний-левый)/2048, Y-смещение = Y нижний-левый.
- В конце процедуры калибровки создайте прямоугольную область интереса (ROI) размером 267x460 пикселей, переместите ее к центру экрана и нажмите кнопку Запустить последовательность.
- Вернитесь к следующим настройкам программного обеспечения для управления камерой: Биннинг: 2x2, Режим триггера: Внешняя экспозиция, Время экспозиции: Минимальное (подлежит определению).
- Режим коррекции автофлуоресценции
Примечание: Уровень покоя [Glu] в окружающей среде активных синаптических окончаний обычно ниже 100 нМ. Соответственно, любой сенсор глутамата, особенно низкоаффинный сенсор, такой как iGluu, будет довольно тусклым при отсутствии синаптического высвобождения глутамата. Тем не менее, некоторая флуоресценция iGluu может быть обнаружена даже в состоянии покоя, но ее следует отличать от тканевой аутофлуоресценции. Освещение с длиной волны 473 нм вызывает как флуоресценцию iGlu,так и автофлуоресценцию (рис. 1A–C). Последний занимает широкий диапазон длин волн, в то время как флуоресценция iGluu ограничена 480–580 нм (с максимумом в 510 нм). Поправка на автофлуоресценцию основана на получении двух изображений с разными фильтрами высоких частот.
- Подготовьте срезы мозга заранее, как описано в другом месте. Держите ломтики отрубей наготове.
- Перенесите срезы в записывающую камеру, погрузив их в оксигенизированную искусственную спинномозговую жидкость (ACSF), содержащую 125 мМ хлорида натрия (NaCl), 3 мМ хлорида калия (KCl), 1,25 мМ ди гидронатрийфосфата (2PO4), 25 мМ бикарбоната натрия (NaHCO3), 2 мМ хлорида кальция (CaCl2), 1 мМ хлорида магния (MgCl2), 10 мМ глюкозы (рН 7,3, 303 мОсм/л), с добавлением 0,5 мМ пирувата натрия, 2,8 мМ аскорбата натрия и 0,005 мМ глутатиона. Используйте расход 1–2 мл/мин. Поддерживайте температуру ванны на уровне 28–30 °C.
- Расположите дорсальный стриатум под целью 20-кратного погружения в воду. Закрепите срезы нейлоновой сеткой на платиновой арфе, чтобы свести к минимуму движение тканей. Переключитесь на объектив погружения в воду 63x /NA 1.0. Выберите фильтры, отражающие свет с длиной волны 473 нм (дихроичное зеркало) и проходящий свет с длиной волны >510 нм (эмиссионный фильтр).
- Синхронизируйте освещение, стимуляцию и получение изображений с помощью аналого-цифровой (АЦП)/цифро-аналоговой (АЦП) (АЦП) (АЦП) платы с соответствующим программным обеспечением для управления. Настройте программу запуска для управления съемкой с временем лазерной экспозиции 180 мс и временем получения изображения 160 мс. Используйте устройство лазерного позиционирования, чтобы направить лазерный луч на заданное количество точек и задайте параметры для Скорости сканирования и Размера пятна.
- Получение изображения как автофлуоресцентных, так иu-положительных структур iGlu с помощью фильтра высоких частот на длине волны 510 нм («желтое изображение»).
- Получите изображение только с помощью автофлуоресценции с помощью фильтра высоких частот с длиной волны 600 нм («красное изображение»).
- Масштабируйте красные и желтые изображения, используя среднюю интенсивность 10 самых ярких и 10 самых темных пикселей, чтобы определить диапазон. Выполните вычитание «желтое минус красное изображение» и измените масштаб вычитаемого изображения для генерации стандартного 8-битного файла tif для удобной визуализации интересующего вас бутона (рисунок 1D). Он содержит яркие пикселииз u-положительных структур iGlu, серые пиксели из фона и темные пиксели из структур с автофлуоресценцией.
заметка: При использовании данного оборудования средняя флуоресценция в состоянии покоя (F) будет ниже 700 А.Е.
- Режим поиска Бутона
Примечание: u-положительные пиксели iGlu могут принадлежать к функционально различным элементам аксонального дерева, таким как ветви аксонов разного порядка, участки бифуркации, варикозные расширения вен после истощения везикул или полностью активные варикозные расширения. Тем не менее, практически невозможно идентифицировать функциональные синаптические терминалы только с помощью визуального осмотра. Таким образом, каждое глутаматергическое синаптическое окончание нуждается в идентификации по его чувствительности к электрической деполяризации. Участки, которые не реагируют на стимуляцию, должны быть отброшены. Физиологическим средством индуцирования высвобождения глутамата из кортикостриатальных аксонов является выявление потенциала действия. Это может быть достигнуто либо с помощью канального родопсина с соответствующими спектральными характеристиками, либо с помощью электрической стимуляции аксона, визуализируемого самим iGluu. Чтобы избежать случайной активации опсина, мы отдали предпочтение последнему апстрайтепу
- Используйте съемник микропипеток (в четырехступенчатом режиме) для получения стимуляционных пипеток из капилляров боросиликатного стекла. Внутренний диаметр наконечника должен быть около 1 мкм. При заполнении ACSF сопротивление электродов должно составлять около 10 МОм.
- Чтобы вызвать потенциал-зависимое от действия высвобождение глутамата из набора синаптических бутонов, прикрепленных к одному и тому же аксону, используйте 63-кратное увеличение, фильтр излучения 510 нм и вычтенное изображение, чтобы поместить стеклянный электрод стимуляции рядом с флуоресцентным варикозом. Избегайте близости дополнительных аксонов.
- Включите стимулятор для подачи импульсов деполяризующего тока в пипетку для стимуляции. Используйте интенсивность тока около 2 мкА (не более 10 мкА).
- Включите многоканальную систему нанесения ванны, в которой один канал подает стандартный раствор для ванны, а другие каналы доставляют необходимые блокаторы ионных каналов, транспортеров или мембранных рецепторов. Контролируйте расход в месте записи, а затем переключитесь на канал тетродотоксина (ТТХ) (раствор ванны плюс 1 мкМ ТТХ). Через 2–3 минуты снова стимулируйте интересующий бутон, но теперь уже при отсутствии генерации потенциала действия. Высвобождение происходит непосредственно за счет притока кальция через кальциевые каналы, зависящие от напряжения.
- Поворачивая клавишу интенсивности на стимуляторе, отрегулируйте ток стимуляции, чтобы получить реакцию, аналогичную той, которая вызывается потенциалами действия. Как правило, ток стимуляции составляет около 6 мкА при деполяризации 0,5 мс.
- Для базового тестирования препарата применяют 0,5 мМ CdCl2. Наличие этого блокатора кальциевых каналов высвобождения глутамата полностью предотвращает синаптическое высвобождение глутамата, тем самым подтверждая кальциеваю зависимость непосредственно вызванного глутаматного сигнала.
заметка: Следующая общая рекомендация может помочь увеличить вероятность успеха экспериментов с одним синапсом в стриатуме. Чтобы выбрать глутаматергические синаптические терминали с интактным механизмом высвобождения, варикозное расширение вен должно: (i) иметь гладкую веретенообразную форму; (ii) не быть связанным с бифуркацией аксонов; (iii) быть ярче других конструкций на «желтом изображении»; (iv) Располагаться в нейронпиле полосатого тела, а не в волокнистых путях; (v) Располагаться на очень тонкой ветви аксона; (vi) Не проживать в более глубоких частях среза.
3. Визуализация высвобождения и выведения глутамата
- Режим записи
ПРИМЕЧАНИЕ: После вычитания автофлуоресценции (шаг 2.2) и нескольких первоначальных тестов на чувствительность интересующего объекта (шаг 2.3) можно приступать к сбору данных. Реакцию на электрическую активацию высвобождения глутамата из одиночных аксонных окончаний можно наблюдать непосредственно на изображении (рис. 2), без применения дополнительных инструментов анализа. Тем не менее, оказалось очень удобным сразу извлечь некоторые основные показатели производительности синапсов (рисунок 3). Эта информация необходима для принятия решений о последующем ходе эксперимента, таких как выбор конкретных типов терминалов, быстрая оценка изменений, связанных с БГ, количество и частота испытаний или препаратов, которые будут применяться с помощью системы суперфузионного синтеза. Также может потребоваться разобраться с появляющимися в конечном итоге артефактами. Сначала описываются стандартные настройки для записи данных.
- С помощью двухкоординатных дисков микроскопа поместите испытанныйu-положительный бутон iGlu близко к центру поля обзора. Остановите получение изображения с помощью кнопки Abort acquisition (Прервать захват). На последнем полученном снимке определите положение по оси XY покоящегося центра бутона, кликнув по нему левой кнопкой мыши. Координаты XY установленного курсора будут отображаться на нижней панели состояния окна сбора данных.
- Используя данные калибровки (шаг 2.1.6), рассчитать координаты участка, куда должен быть направлен лазерный луч для возбуждения флуоресценции iGlu. Используйте следующие уравнения: X лазер = X камера * X фактор + X смещение, Y лазер = Y смещение – Y камера * Y фактор. Выполняя этот пересчет, обратите внимание на настройки вертикального или горизонтального переворота камеры.
- Создайте последовательность из одной точки в программном обеспечении для управления лазером, используя рассчитанные координаты. Для этого выберите «Точка» в поле «Добавить в последовательность» на странице «Последовательность» программного обеспечения для управления лазером. Выберите 10 мкс для задержки начала срабатывания и 180 мс для времени лазерного импульса. Наведите мышь на рассчитанные координаты и нажмите левую кнопку.
- Выберите следующие настройки в программном обеспечении для управления лазером: Запуски: 0, Задержка выполнения: 0, Последовательность: Запуск с TTL. Затем нажмите кнопку Начать последовательность.
- В программном обеспечении для управления камерой выберите следующие настройки: На странице Биннинг/ROI установите Область изображения: Пользовательская, Объединение пикселей: 2x2, Высота: 20, Ширина: 20, Слева: X-координатапокоящегося u-положительного пятна iGlu минус 10 пикселей, Внизу: Y-координатапокоящегося u-положительного пятна iGlu минус 10 пикселей, Режим съемки: Кинетическая серия, Длина кинетического ряда: 400, время экспозиции: 0.0003744с (минимальное значение). При таких настройках скорость захвата составит 2,48 кГц.
- Выберите Режим триггера: Внешний. Нажмите Принять сигнал в программном обеспечении для управления камерой. Инициируйте протокол эксперимента, заложенный для пускового устройства.
- Реализуйте экспериментальный протокол исследования со следующей временной шкалой: 0 мс – начало испытания, 1 мс – начало лазерного освещения, 20 мс – начало получения изображения с помощью камеры, 70 мс – начало электростимуляции 1, 120 – начало электростимуляции 2, 181 мс – окончание испытания (лазер и камера выключены). Таким образом, за одно испытание камера набирает 400 кадров с частотой 2,48 кГц. Смотрите шаги 2.3.3 и 2.3.5. для получения подробной информации об электростимуляции.
- Чтобы обеспечить достаточное восстановление пресинаптических бассейнов везикул, применяйте протокол Trial с частотой повторения 0,1 Гц или ниже.
- Off-line конструирование глутаматного транзиента и экспресс-оценка высвобождения и клиренса глутамата для идентификации патологических синапсов
- Включите процедуры оценки. Здесь мы используем программное обеспечение собственного производства SynBout v. 3.2. (автор: Антон Дворжак). Для построения ΔF/F переходного процесса из пикселей с повышенной флуоресценцией iGluu необходимы следующие шаги, как показано на видео на рисунке 2.
- Чтобы определить размер бутона, рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение (SD) интенсивности флуоресценции ROI в состоянии покоя (F) до начала стимуляции. Определите и упакуйте область, занимаемую пикселями, с F>средним + 3 SD (рис. 3A). Определите виртуальный диаметр (в мкм) с учетом круглой формы надпороговой области.
- Определите ΔF как разность между значением пиковой интенсивности и F. Построите график зависимости стимулирующего тока и ΔF/F от времени (рисунок 3B). Рассчитайте SD ΔF/F в состоянии покоя (до начала стимуляции) и «Пиковую амплитуду». Используйте пиксель с пиковой амплитудой более 3 SD от ΔF/F для выполнения моноэкспоненциальной подгонки для затухания от пика. Определите постоянную времени распада TauD от ΔF/F.
- Чтобы оценить «Максимальную амплитуду» в заданном синапсе, выберите пиксель с наибольшим значением ΔF/F. Обычно он расположен в пределах или рядом с границами флуоресценции покоящегося бутона. «Максимальная амплитуда» была бы лучшим индикатором нагрузки глутамата, представляемой механизму клиренса одного синапса.
