Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Хирургия
- Для электрофизиологической записи используйте уретан (ОСТОРОЖНО) для анестезии.
осторожность: Уретан токсичен и канцерогенен, поэтому всегда соблюдайте правила техники безопасности и паспорт, предоставленный производителем вещества.
- Приготовьте раствор уретана 200 мг/мл в 0,9% растворе хлорида натрия (NaCl) медицинского физиологического раствора.
- Введите в общей сложности 1,3 г/кг уретана с массой тела внутрибрюшинно (ВП). В зависимости от штамма крысы может быть разумно разделить дозу на две дозы с интервалом в 15 минут между инъекциями, чтобы повысить безопасность анестезии.
- Проверьте глубину анестезии с помощью педально-отводящего рефлекса и других подходящих рефлексов. Если анестезия недостаточно глубока для проведения операции, введите 0,15 г/кг массы тела уретана IP и подождите еще 15 минут.
- Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы.
- Постоянно контролируйте частоту дыхания и рефлекс отведения педалей во время анестезии. Используйте грелку для небольших животных с контролем температуры, чтобы обеспечить поддержание физиологической температуры тела на протяжении всей операции. Перед началом электрофизиологической записи смените насадку на неэлектрическую (например, насадку на головку из ацетата натрия).
- Сбрейте шерсть вдоль спинной стороны головы, чтобы получить чистое операционное поле. Продезинфицируйте вокруг места разреза соответствующим хирургическим дезинфицирующим средством. Зафиксируйте животное в стереотаксической рамке.
- Выполните скальпелем разрез кожи головы длиной 2 см в сагиттальном направлении. С помощью скальпеля слегка соскребите апоневроз черепа и продезинфицируйте череп. Используйте ватные палочки, смоченные в 3% перекиси водорода (H2O2), чтобы удалить остатки ткани.
- При необходимости используйте электрокаутер или термокаутер для остановки кровотечения. Остановите кровотечения из костей черепа и подкожной клетчатки, если кровотечение не прекращается спонтанно через 1-2 минуты и затрудняет зрение на череп.
- Отрегулируйте стержень резцов до тех пор, пока головка не окажется в положении плоского черепа, что означает, что брегма и лямбда как стереотаксические опорные точки находятся в одной плоскости. Это наиболее важно для достижения высокой хирургической точности. Используйте стандартный стереотаксический инструмент для выравнивания крысы, откалибруйте назначенный наконечник по брегме под микроскопическим зрением и отрегулируйте резец до тех пор, пока назначенные точки для брегмы и лямбды на инструменте не коснутся черепа одновременно.
заметка: Вид с одной стороны и сфокусированный свет с другой может помочь определить это состояние. В качестве альтернативы возьмите стереотаксический держатель с тонкой канюлей и измерьте дорсовентральные координаты брегмы и лямбды под микроскопическим зрением. Отрегулируйте планку резцов до тех пор, пока дорсовентральные координаты брегмы и лямбды не совпадут.
- Используйте стереотаксический держатель с канюлей, откалибруйте по брегме, а затем рассчитайте положение всех просверленных отверстий на черепе. С помощью стереотаксического держателя отметьте положение отверстий, которые необходимо просверлить, тщательно поцарапав череп или используя хирургический цветной маркер. Координаты для этого зависят от целей; Координаты относительно брегмы приведены для гиперпрямого пути в таблице 1, включая рекомендуемые координаты для мозжечковых электродов сравнения.
- С помощью микродрели тщательно просверлите все отверстия. Для ядра субталамуса (STN) и черной сеточной субстанции (SNr) просверлите общее отверстие (размером примерно 2 мм x 3 мм). Все остальные отверстия должны иметь диаметр около 1 мм.
- Возьмите две тонкие канюли (не менее 27 г) и согните их кончики, чтобы сформировать крючковатую форму, используя твердую поверхность или пинцет. Используйте их для удаления мусора из отверстий, а также аккуратно отрежьте и удалите твердую мозговую оболочку в общем отверстии STN/SNr.
- Просверленные отверстия промойте физиологическим раствором. Наносите каплю физиологического раствора каждые 15 минут на отверстия, чтобы предотвратить высыхание мозга и твердой мозговой оболочки.
- Возьмите микродрель и подходящий микровинт из нержавеющей стали (например, винт M 1,2 мм x 2 мм), просверлите отверстие и вкрутите микровинт между отверстиями эпидуральных электродов сравнения над мозжечком, проделайте то же самое для эпидуральных электродов M1.
- Вставьте самодельные эпидуральные электроды Ag/AgCl в отверстия для электродов сравнения и электродов M1. Направьте наконечник электрода тонким пинцетом и вставьте его прямо под кость черепа в отверстие
.
- Зафиксируйте все эпидуральные электроды двухкомпонентным стоматологическим акрилом. Убедитесь, что вы не закрываете точку брегмы и не затрагиваете общее отверстие STN/SNr.
- Вставьте подготовленный держатель с вольфрамовыми электродами из микропровода в стереотаксическую раму.
- Откалибруйте самый вентральный электрод, который предназначен для нацеливания на STN, по брегме. Отрегулируйте расчетное положение над общим отверстием STN/SNr и опустите электроды вниз к мозгу под микроскопическим зрением. Убедитесь, что электроды с вольфрамовым микропроводом плавно входят внутрь мозга.
2. Электрофизиологическое картирование и запись
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага необходима клетка Фарадея и многоканальная электрофизиологическая система записи с записывающим программным обеспечением, способная к онлайн-фильтрации и онлайн-сортировке спайков. Предпочтительно использовать систему, которая работает с предварительным усилителем, расположенным рядом с головой животных, чтобы свести к минимуму электрические шумы и артефакты. Помимо вольфрамовых электродов с микропроволокой, для записи гиперпрямого пути необходим как минимум один эпидуральный электрод и один электрод сравнения. Эпидуральные и референсные электроды рекомендуется вставлять попарно, не соприкасаясь друг с другом, это помогает в случае неисправности и позволяет использовать различные типы ссылок при анализе данных.
- Поместите мобильную клетку Фарадея над стереотаксической рамой. Если доступна только стационарная клетка Фарадея, осторожно переместите стереотаксическую рамку в клетку Фарадея, следя за тем, чтобы глубокие электроды мозга не опускались в мозг до тех пор, пока стереотаксическая рамка не окажется в своем окончательном положении.
- Подсоедините электроды к головному столу электрофизиологической установки. Убедитесь, что электроды сравнения подключены к соответствующим каналам сравнения.
- Настройте программное обеспечение для записи: полосовой фильтр (0,05-8 000 Гц) и усилите (усиление в 1 500-2 000 раз) исходный сигнал данных. Используйте онлайн-фильтр LFP и спайк-фильтр с соответствующими настройками (полосовой фильтр 0,05-250 Гц для LFP, полосовой фильтр 300-8 000 Гц для MUA). Для всех фильтров используйте фильтр типа Баттерворта.
- Настройте пороговое значение пиков, если применимо, для сортировки пиков в интернете. Большинство программ для записи позволяют установить порог спайка, который представляет собой значение амплитуды, выше которого сигнал помечается программным обеспечением как спайк. Этот порог может быть определен либо математически как фактор или стандартное отклонение от средней амплитуды отфильтрованного сигнала спайка, либо предпочтительно может быть определен путем визуального осмотра сегментов данных <500 мс и установлен в виде линии над шумом сигнала в графическом пользовательском интерфейсе><.
заметка: Цель установки порога спайков состоит в том, чтобы подсчитать пики и отсортировать единицы, чтобы предоставить информацию о том, сколько нейронов в данный момент записано и как сформированы их спайки.
- Медленно опустите вольфрамовые микропроволочные электроды на 1 мм дорсально от мишени, что является STN для гиперпрямого пути. При необходимости дождитесь стабилизации сигнала.
- Для электрофизиологического картирования продвигайте электроды вентрально с шагом 100 мкм. На каждом шаге оценивайте схему стрельбы, скорость стрельбы и форму шипов. Сравните их с типичными примерами, приведенными на рисунке 1. Как правило, плотные ядра демонстрируют быстрые и непрерывные спайки на протяжении нескольких дорсовентральных ступеней, в то время как богатые волокнами структуры демонстрируют низкую скорость возбуждения и менее однородную спайковую активность на последующих вентральных ступенях.
- Для гиперпрямого пути убедитесь, что самый вентральный электрод находится внутри STN.
заметка: STN достигается, когда обнаруживается значительное увеличение MUA вентрально от Zona incerta. Вентрально по отношению к STN спайкинг прекращается почти полностью, потому что электрод достиг внутренней капсулы. Когда самый вентральный электрод находится в STN, конфигурация вольфрамовых микроэлектродов гарантирует, что задний, второй электрод находится в SNr. Дорсовентральная тонкая настройка с небольшими приращениями может потребоваться для одновременной регистрации типичного MUA в STN и SNr. Отметим, что частота MUA зависит от количества фактически зарегистрированных нейронов и от уровня активации мозга.
- После того, как электроды окажутся в нужных структурах, настройте онлайн-фильтрацию и сортировку спайков (см. рис. 2), а затем начните запись данных. Типичные примеры различных состояний синхронизации коры головного мозга, которые могут быть идентифицированы в записях LFP, показаны на рисунке 3.
Таблица 1: Стереотаксические координаты для записи гиперпрямого кортико-базального пути ганглий. Все точки измеряются от точки отсчета брегмы на черепе в мм; n.a.- не применяется.
| Координаты из Брегмы | СТН | SNr | М1 | Ссылка 1 | Ссылка 2 |
| передне-задний | -3.6 | -4.8 | +3,0 | -10.0 | -10.0 |
| медиально-латеральный | +2,5 | +2,5 | +3,0 | +3,0 | -3.0 |
| дорсально-вентральный | -8.0 | н. а. | н. а. | н. а. | н. а. |
