Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Ежедневная подготовка экспериментальной аппаратуры
- Включите усилитель, компьютер и систему камер и убедитесь, что программное обеспечение запущено.
- Поместите искусственную спинномозговую жидкость (ФЦБ) в пробирку объемом 50 мл и пузырь с карбогеном.
- Используйте перистальтический насос для циркуляции ACSF. Отрегулируйте расход примерно до 1 мл/мин.
- Отрегулируйте высоту всасывающего пипетки так, чтобы уровень жидкости внутри экспериментальной камеры всегда был постоянным.
заметка: Уровень раствора важен для получения стабильной записи, поэтому регулировку следует производить с помощью микроманипулятора.
- Установите заземляющий электрод, состоящий из желтой микросхемы, заполненной 3 М KCl агаром (2%), в держатель с проводом Ag-AgCl с небольшим количеством 3 М раствора KCl.
- Залейте небольшое количество ACSF (примерно две трети объема) в стеклянный электрод (внешний диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,78 мм, вытягиваемый с помощью съемника микропипетки) с помощью конического тонкого трубчатого желтого наконечника и поместите его в держатель электрода.
- Прикрепите держатель к стержню, установленному в манипуляторе. При использовании усилителя убедитесь, что сопротивление электродов составляет примерно 1 МОм.<бр/>
заметка: Патч-электрод с широким отверстием длинного хвостовика (4-8 мкм) должен быть хорош для регистрации в полевых условиях и в качестве стимулирующего электрода.
2. Начало сессии записи
- Возьмите срез заготовки из влажной камеры с щипцами.
- Быстро поместите срез в экспериментальную камеру под микроскопом (рис. 1).
- Плотно вставьте край кольца в силиконовое уплотнительное кольцо. Будьте осторожны, чтобы не повредить мембрану или дно экспериментальной камеры.
заметка: Направление среза следует учитывать по отношению к направлению стимулирующих и регистрирующих электродов в поле зрения. Здоровый ломтик должен прилипнуть к мембранному фильтру, поэтому нет необходимости использовать другие приспособления для фиксации срезов, такие как грузики и капроновые сетки.
- Поместите наконечник стимулирующего электрода и электрод с регистрацией потенциала поля на срез под микроскопом с проходящим светом.
- Используйте электрофизиологическую систему регистрации для проверки реакции. Подтвердите обычную (неокрашенную) электрофизиологическую запись с заданной конфигурацией.
заметка: Записывающий электрод может быть опущен, но он полезен для проверки физиологии среза.
- Отрегулируйте интенсивность возбуждающего света примерно до 70-80% от максимальной мощности камеры, что соответствует 13-15 мВт/см2 на образце при отборе проб с частотой 10 кГц с 5-кратным объективом погружения в воду и 1-кратным тубусным объективом PLAN APO. Длина волны возбуждающего света составляет 530 нм, а эмиссионный фильтр должен быть > 590 нм.<бр/>
заметка: Используйте затвор, чтобы свести к минимуму количество возбуждающего света. Постоянное воздействие света может ухудшить физиологию среза. Возможное вредное воздействие света зависит от интенсивности и продолжительности света. Используйте электрофизиологическую запись, чтобы оценить эффект света. При интенсивности 13-15 мВт/см2 воздействие около 1 с должно быть верхним пределом допуска.
- Отрегулируйте фокус с помощью системы сбора данных с помощью источника флуоресцентного света, поскольку фокус может отличаться в зависимости от длины волны и начала захвата.
- Изучите данные в программном обеспечении для получения изображений.
заметка: Для детального анализа мы использовали оригинальный микропрограммный пакет программ численного анализа.
