Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Животные
- Используйте генетически модифицированных мышей OR-IRES-tauGFP (OR = обонятельный рецептор, IRES = внутренний сайт входа рибосом, tauGFP = тау-зеленый флуоресцентный белок), доступных в лаборатории Джексона. Эти мыши были разработаны в лаборатории доктора Питера Момбертса с целью анализа нацеливания на аксоны и развития обонятельной системы. Например, линейка MOR23-IRES-tauGFP, биржевой номер 006643, носит официальное название штамма B6; 129P2-Olfr16tm2Mom/MomJ; аналогично, линейка SR1-IRES-tauGFP, биржевой номер 6717, носит официальное название B6; 129P2-Olfr124tm1Мама/МамаJ.
- Что касается возраста животных: для лучшего результата протокола используйте животных в возрасте от 2 до 4 недель. В этой возрастной группе рассечение происходит легче (более мягкие кости, более твердый обонятельный эпителий), а дендритные бугорки больше по сравнению с пожилыми животными.
2. Приготовление электродов и растворов
- Для стимулирующих пипеток: приобретайте предварительно вытянутые стимулирующие пипетки. В противном случае подготовьте их вручную.
- С помощью пламени согните шесть стеклянных пипеток диаметром 1 мм примерно в 1 см от кончика. Вставьте эти шесть пипеток плюс прямую 7-ю в 1,5 см термоусадочную трубку, усиленную проушиной.
- Термоусадка трубки для поддержания крепления стволов друг к другу. Прикрепите дополнительную термоусадочную трубку к другому концу стволов. Вытяните эту стимулирующую пипетку с помощью многоствольного пуллера.
- Добавьте немного белого жидкого клея вокруг проушины, чтобы укрепить загнутые кончики. Дайте высохнуть в течение ночи (O/N).
- Приготовьте 1 или 2 л нормального внеклеточного раствора Рингера (в мМ: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26,2PO4 1,25, глюкоза 15; pH 7,6 и 305 мОсм). Держите при температуре 4 °C до использования.
- Приготовьте внутриклеточный стоковый раствор (в мМ): KCl 70, KOH 53, метансульфоновую кислоту 30, этиленгликоль тетрауксусную кислоту (EGTA) 5, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновую кислоту (HEPES) 10, сахарозу 70; pH 7,2 (KOH) и 310 мОсм. Держите при температуре 4 °C до использования. Хорош в течение нескольких недель.
- Приготовьте раствор для внутриклеточной регистрации с нистатином импровизированно (в последнюю минуту) перед экспериментом.
- Взвесьте 3 мг нистатина, добавьте 50 μл диметилсульфоксида (ДМСО); вахрите 20 секунд, затем обточите 2-3 минуты до полного разбавления.
- Добавьте 20 мкл раствора ДМСО-нистатина в 5 мл внутриклеточного исходного раствора. Вихрь 20 сек, затем ультразвуковая обработка 3 мин. Держите этот раствор при температуре 4 °C и беречь от прямых солнечных лучей, нистатин чувствителен к свету. Такой раствор можно использовать в течение нескольких часов. Заменяйте каждый день.
- После того, как препарат обонятельного эпителия окажется под микроскопом, возьмите немного этого раствора в шприц объемом 1 мл с удлиненным желтым наконечником пламени для заполнения электродов; беречь от прямого света. При комнатной температуре (RT) раствор нистатина не стабилен; Заменяйте раствор в шприце объемом 1 мл каждый час или храните его в льду.
- Потяните записывающие электроды с помощью съемника, чтобы получить длинную шейку и маленький наконечник (~2 мкм) с сопротивлением 15-20 МОм с внутренним раствором нистатина.
- Приготовьте раствор одоранта при температуре 0,5 М в ДМСО под вытяжным шкафом; аликвоту и выдерживайте при -20 °C до использования. Разведите одорант в растворе Рингера до нужной концентрации. Наполните стимулирующую пипетку.
3. Подготовка обонятельного эпителия
Примечание: мыши OR-IRES-tauGFP экспрессируют tauGFP под контролем промотора OR. У этих мышей все нейроны, экспрессирующие интересующее нас ИЛИ, помечены GFP. Этот протокол адаптирован для ОШ, выраженных во всех зонах. Тем не менее, вскрытие и запись легче поддаются ОШ, экспрессируемым в дорсальной зоне.
- Обезболивайте животное путем введения смеси кетамина и ксилазина (150 мг/кг и 10 мг/кг массы тела соответственно). Обезглавливание может быть выполнено острыми ножницами для молодых мышей или с помощью правильно ухоженной гильотины для грызунов для более старых мышей.
- С помощью кольцевых ножниц для пресечения делают продольный медиальный разрез через тыльную сторону кожи. Снимите кожицу, раздвинув ее. С помощью ножниц разрежьте нижние челюсти в месте челюстного сустава. Удалите верхние передние зубы коронковым разрезом, параллельным зубам.
- Сделайте корональный разрез головы за глазами и оставьте только переднюю часть головы. Опустите его в ледяной раствор Рингера для вскрытия под прицелом.
- Рассекайте под прицелом: в брюшной части сделайте продольный разрез вдоль верхней челюсти/зубов. Разрежьте спинные кости в продольном направлении, следуя дорсолатеральной стороне носовой полости. Удалите большую часть костей и нёба; пересадка перегородки и прикрепленного к ней эпителия в кислородонасыщенный Рингер при лучевой терапии.
- Для окончательного вскрытия: Непосредственно перед началом сеанса записи отклейте эпителий от нижележащей перегородки с помощью щипцов. Отделите эпителий щипцами и двумя ножницами диаметром 4-5 мм (используйте микрованны) в передней части перегородки, где адгезия сильнее.
- Аккуратно удалите вомероназальный орган, вырезав его по дорсальному соединению с эпителием перегородки. Перенесите эпителий в записывающую камеру слоем слизи вверх; Держите его в камере плашмя с помощью арфы.
- Установите камеру под вертикальный микроскоп, оснащенный флуоресцентной оптикой и чувствительной камерой. Визуализируйте подготовку на экране компьютера при большом увеличении с помощью 40-кратного водно-иммерсионного объектива (числовая апертура 0,8) и дополнительном 2-кратном или 4-кратном увеличении, достигаемом с помощью увеличительной линзы. Непрерывно проводить с помощью оксигенированного Ringer во время РТ (1-2 мл/мин).
4. Сессия записи
- Поиск флуоресцентных элементов: возбуждать препарат на длине волны 480 нм для EGFP, который излучает свет в диапазоне 530-550 нм; нацеливаться на один дендритный бугорок, который надежно виден во флуоресценции и при ярком поле.
- Заполните электрод внутриклеточным раствором с нистатином; удалите пузырьки, аккуратно постукивая по электроду.
- Вставьте электрод в держатель электрода, надавите положительным давлением в пипетку; Сопротивление должно составлять 15-20 МОм.
- Поднесите электрод близко к элементу; как только сопротивление достигнет ~40 МОм, отпустите положительное давление и приложите небольшое отрицательное давление, чтобы достичь гигауплотнения.
- Как только уплотнение будет достигнуто, установите потенциал мембраны на уровне около -75 мВ;
- После того, как ячейка будет открыта, приступайте к протоколам стимуляции, фармакологическому лечению. Чтобы измерить реакцию на стимуляцию одного одоранта, зарегистрируйте спонтанную активность в течение 200-500 мс, стимулируйте в течение 500 мс и измерьте реакцию клетки в течение 10 секунд. Для фармакологического лечения перфузируйте фармакологические средства в нужной концентрации.
