Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выравнивание оптического пути между камерой CMOS (комплементарный металлический оксидный полупроводник) и отдельным или разветвляющимся патч-кордом
- Ослабьте все винты на 5-осевом трансляторе (Рисунок 1B).
- Вкрутите патч-корд (рис. 1B) в адаптер [SMA (субминиатюрный A) или FC (оптоволоконный разъем)], который прикреплен к 5-осевому транслятору.
- Включите индикатор возбуждения с длиной волны 470 нм (рис. 1B) на малой мощности (100 мкВт) и поместите кончик патч-корда на автофлуоресцентное пластиковое стекло. Это не имеет никакого отношения к будущим записям, а предназначено исключительно для визуализации процесса выравнивания.
- Запись с CMOS-камеры (рис. 1B) в режиме реального времени. Увеличьте усиление или настройте таблицу преобразования (LUT) до тех пор, пока изображение не станет полностью черным. Суть в том, чтобы иметь возможность видеть изображение в фокусной точке объектива (рис. 1B).
- Переместите 5-осевой транслятор к объективу, следя за тем, чтобы свет с длиной волны 470 нм был центрирован на оптоволокне на конце патч-корда SMA или FC до тех пор, пока изображение не будет получено на камере.
- Отрегулируйте оси X и Y до тех пор, пока изображение не будет центрировано и хорошо разрешено.
- Визуализируйте свет, излучаемый наконечником наконечника патч-корда. Он должен выглядеть в виде изотропного круга. Если используется ветвящийся патч-корд, количество света, излучаемого на концах наконечника каждого патч-корда, должно быть одинаковым. Если круг не изотропен или излучаемый свет неравномерен, настройте 5-осевой транслятор по оси X-Y.
2. Настройка ROI вокруг волокон для измерения средней интенсивности флуоресценции
- Включите все возбуждающие лампочки, чтобы лучше визуализировать волокна. Отрегулируйте усиление камеры так, чтобы пиксели не переполнялись и чтобы волокна были четкими.
- Запись в режиме реального времени или создание предварительного изображения.
- Нарисуйте ROI вокруг волокон и сохраните их для измерения средних значений интенсивности во время записи (рис. 1A).
- Для записи по нескольким оптоволоконным кабелям проверьте независимость сигналов.
- Живая запись со всех волокон.
- Направьте одно волокно в сторону источника света и постучите пальцем. Большие колебания должны происходить только в этом канале (допустимая утечка 1:1000).
- Если сигналы не являются независимыми, перерисуйте более консервативные ROI и повторите тест на независимость.
- Чтобы маркировать и отслеживать, какой ROI соответствует какому волокну, цветную ленту или лак для ногтей можно нанести на конец волокон. Сделайте снимок перед началом любого эксперимента в качестве вторичного напоминания.
3. Настройка сцены для записи
- Повесьте патч-корд над ареной с помощью подставок, зажимов или держателей.
- Убедитесь, что животное может свободно перемещаться по всей арене, не стесняясь длины волокна.
- Если используется оперантная коробка или открытое поле, убедитесь, что патч-корд может добраться до животного с минимальным изгибом. Если для этого требуется тыкать носом, убедитесь, что над головой достаточно места, чтобы предотвратить изгиб волокна. Избегайте чрезмерного сгибания или скручивания патч-корда.
4. Записи in vivo
- Визуально осмотрите дистальный конец волокон патч-корда на глаз и с помощью микроскопа из минифибры. Если поверхность волокон поцарапана, повторно отполируйте волокна с помощью пленки для полировки/притирки волокон с мелкой зернистостью (1 мкм и 0,3 мкм).
- Очистите дистальные концы патч-корда 70% этанолом и аппликатором с ватным наконечником.
- Очистите оптоволоконные канюли с помощью 70% этанола и аппликатора с ватным наконечником.
- Соедините наконечник патч-корда с имплантируемым волокном с помощью керамической разъемной втулки, покрытой черной термоусадочной трубкой. Убедитесь, что втулка плотно прилегает во время соединения. В противном случае используйте новый рукав.
заметка: Если между наконечником патч-корда и имплантатом есть какое-либо пространство, произойдет большая потеря сигнала, и запись не будет работать.
- Дайте животному прийти в себя за несколько минут до начала поведенческого тестирования.
- Начните запись оптического сигнала и проведите эксперимент.
- Во время записи внимательно следите за трассировкой в реальном времени, чтобы обеспечить качество записи. Ожидается, что сигнал будет быстро уменьшаться в зависимости от времени в течение первых 2 минут записи. Этот эффект вызван тепловым затуханием светодиодов, в результате чего увеличение нагрева увеличивает сопротивление оптического элемента.
- Если происходит скачок сигнала, превышающий кинетику включения/выключения GCaMP, это часто указывает на то, что втулка недостаточно плотная и пространство между патч-кордом и имплантатом меняется. В этом случае остановите эксперимент и снова соедините животное с помощью новой втулки.
