Электрофизиологическое исследование ретиногеникулатных и кортикогеникулатных синапсов в срезах мозга мышей

Аннотация

Источник: Chen, X., et al. Электрофизиологические исследования функции ретиногеникулята и кортикогеникулята синапса. J. Vis. Exp. (2019).

Видео описывает электрофизиологическую регистрацию ретиногеникулят и кортикогеникулят синапсов в срезах мозга мыши. Срезы, содержащие дорсальное латеральное коленчатое ядро (dLGN), помещают в записывающую камеру. Стимулирующая пипетка располагается либо на зрительном тракте для стимуляции ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и исследования ретиногеникулят синапсов, либо на ядре ретикулярного талами для стимуляции корковых нейронов и исследования кортикогеникулатных синапсов. При стимуляции RGC и корковые нейроны высвобождают возбуждающие нейротрансмиттеры, которые производят синаптические токи в релейных нейронах LGN. Эти токи регистрируются с помощью записывающей пипетки с патч-клемтом.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Решения

1. Диссекционный раствор
   1. Для снижения эксайтотоксичности приготовьте раствор на основе холина, который будет использоваться во время вскрытия, как показано здесь (в мМ): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 холина хлорида, 25 NaHCO₃, 1,25₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂ и 25 глюкозы. Приготовьте раствор для вскрытия менее чем за 1 неделю до эксперимента.
2. Решение для записи
   1. Приготовьте раствор искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), содержащий (в мМ): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25₂PO₄, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ и 25 глюкозы. Добавьте 50 мкМ D-2-амино-5-фосфоновалеровой кислоты (D-APV) и 10 мкМ SR 95531 гидробромида (габазина) для блокирования рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDA) и ГАМК, соответственно.
3. Внутриклеточное решение
   1. Приготовьте внутриклеточный раствор, содержащий (в мМ): 35 Cs-глюконат, 100 CsCl, 10 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновую кислоту (HEPES), 10 этиленгликоль тетрауксусную кислоту (EGTA) и 0,1 D-600 (метоксиверапамила гидрохлорид). Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью CsOH. Отфильтруйте, аквотируйте и храните исходный раствор при температуре -20 °C до использования.

2. Вскрытие

1. Подготовьте две срезные камеры, одна из которых заполнена 100 мл раствора для вскрытия, а другая — 100 мл раствора для вскрытия. Поместите два стакана на водяную баню (37 °C) и взбивайте растворы карбогеном в течение не менее 15 минут перед вскрытием.
2. Наполните пластиковый стакан 250 мл почти ледяного (но не замороженного) раствора для вскрытия. Пузыри с карбогеном не менее чем за 15 минут до использования.
3. Наполните пластиковую чашку Петри (100 мм х 20 мм), в которой будет производиться диссекция мозга, раствором для холодной диссекции. Положите лист фильтровальной бумаги в крышку чашки Петри.
4. Охладите камеру рассечения вибратома.
5. Обезболите мышь 2,5% изофлураном, например, в мышиной клетке. Как только мышь перестанет реагировать на пощипывание хвоста, обезглавьте мышь возле шейного мозгового вещества и погрузите голову в ледяной раствор для вскрытия в основании чашки Петри.
6. Разрежьте кожу головы от хвостальной до носовой и держите ее сбоку пальцами, чтобы обнажить череп. Чтобы удалить передний мозг, сначала разрежьте череп вместе с задне-передней средней линией, а затем еще два раза разрезайте корональный шов и лямбдоидный шов (рисунок 1А).
7. Удалите череп между корональным швом и лямбдоидным швом таким образом, чтобы обнажить головной мозг. Разрежьте обонятельную луковицу и отделите передний мозг от среднего мозга с помощью тонкого лезвия (рис. 1B). Извлеките мозг из черепа с помощью тонкого шпателя и положите его на фильтровальную бумагу в крышке чашки Петри.
   заметка: Шаги 2.6 и 2.7 должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы уменьшить гибель клеток.
8. Чтобы сохранить целостность сенсорных и корковых входов к dLGN в срезе мозга, разделите два полушария парасагиттальным разрезом с углом 3−5° (рис. 1C, D). Высушите медиолатеральные плоскости двух полусфер, поместив их на фильтровальную бумагу, а затем приклейте их к режущему столику под углом 10−25° от горизонтальной плоскости (рисунок 1Е).
9. Поместите предметный столик в центр металлического буферного лотка и аккуратно вылейте оставшийся ледяной раствор для вскрытия в буферный лоток. Выполняйте этот шаг осторожно, так как сильная заливка может удалить приклеенный мозг (Рисунок 1F).
10. Поместите буферный лоток в лоток, наполненный льдом, что помогает поддерживать низкую температуру во время вскрытия. Ломтики размером 250 мкм нарезать лезвием бритвы со скоростью 0,1 мм/с и амплитудой 1 мм.
11. Держите срезы в камере хранения, заполненной кислородосодержащим раствором для рассечения при температуре 34 °C, в течение примерно 30 минут, а затем дайте срезам восстановиться в растворе для записи при 34 °C в течение еще 30 минут.
12. После восстановления снимите камеру для хранения ломтиков с водяной бани и держите ломтики при комнатной температуре (RT) до использования в экспериментах.

3. Электрофизиология

1. Вытягивайте пипетки с помощью капилляров из боросиликатного стекла и съемника нити. Поддерживайте сопротивление записывающих пипеток на уровне 3−4 МОм. Вытягивайте стимулирующие пипетки, используя тот же протокол, но слегка сломайте наконечник после вытягивания, чтобы увеличить диаметр. Заполняйте записывающие пипетки внутриклеточным раствором и биоцитином, в то время как стимулирующие пипетки заполняйте записывающим раствором.
2. Поместите срезы в записывающую камеру и непрерывно перфузируйте срезы кислородосодержащим раствором для записи в режиме RT. Проверьте все слайсы и выберите те, на которых виден неповрежденный оптический тракт.
3. Визуализируйте срез и клетки с помощью вертикального микроскопа, оснащенного инфракрасной дифференциально-интерференционно-контрастной видеомикроскопией (IR-DIC).
   заметка: Релейные нейроны отличаются от интернейронов большим размером сомы и большим количеством первичных дендритов (ветвей, выходящих из сомы). Интернейроны демонстрируют биполярную морфологию с меньшей сомой.
4. Поместите стимулирующую пипетку на срез перед тем, как залатать ячейку записывающей пипеткой. Чтобы исследовать ретиногеникулированные синапсы, поместите стимулирующую пипетку непосредственно в зрительный тракт, где сгруппированы волокна аксонов из ганглиозных клеток сетчатки (рис. 2A). Чтобы проанализировать кортикогеникулярные синапсы, поместите стимулирующий электрод на ядро ретикулярного талами, которое ростровентрально прилегает к dLGN (рис. 2B).
5. После того как записывающий пипетка будет погружен в записывающий раствор, подайте усилие напряжения 5 мВ для контроля сопротивления пипетки. Установите удерживающий потенциал на 0 мВ и отмените потенциал смещения так, чтобы удерживающий ток был равен 0 пА.
6. Подойдите к ячейке с помощью записывающей пипетки, оказывая положительное давление. Когда пипетка находится в непосредственном контакте с клеточной мембраной, сбросьте положительное давление и установите потенциал удержания на -70 мВ. Приложите небольшое отрицательное давление, чтобы клеточная мембрана прикрепилась к стеклянной пипетке таким образом, чтобы образовалось гигаомное уплотнение (сопротивление >1 ГОм). Компенсировать емкость пипетки и открыть ячейку с помощью импульсов отрицательного давления.
7. Чтобы исследовать синаптическую функцию, подайте импульсы тока 0,1 мс (около 30 мкА) через стимуляционную пипетку. Если синаптических реакций не наблюдается, возможно, придется заменить стимулирующие пипетки. Будьте осторожны при размещении стимулирующих пипеток в другом положении, чтобы не потерять записанную ячейку.
   заметка: В примерах записей, показанных на рисунке 2, кратковременная пластичность синапсов исследовали путем стимуляции зрительного тракта или кортикогеникулатных волокон дважды с интервалами между стимулами по 30 мс. Отношение парных импульсов (PPR) рассчитывали путем деления амплитуды второго возбуждающего постсинаптического тока (EPSC) на амплитуду первого EPSC (EPSC2/EPSC1). Каждый протокол стимуляции повторялся по 20 раз. Амплитуда EPSC измерялась по средним течениям 20 разверток. Временной интервал между каждым повторением составлял не менее 5 с, чтобы избежать кратковременной пластичности, вызванной повторениями.
8. Непрерывно контролируйте последовательное сопротивление, применяя шаг напряжения 5 мВ. Для анализа используйте только ячейки с последовательным сопротивлением менее 20 МОм.

Результаты

Рисунок 1: Схемы, представляющие собой протокол вскрытия. (A) Горизонтальный вид черепа мыши, показывающий положение первоначальных надрезов. Первый разрез был выполнен вместе с сагиттальным швом, за ним последовали еще два разреза вместе с корональным швом и лямбдоидным швом соответственно. Пунктирными линиями обозначены надрезы. (Б) Сагиттальный взгляд на весь мозг...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
усилитель	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Двойной усилитель с патч-клещом
CaCl2	ЭМСУРА	1.02382.1000
холина хлорид	Сигма-Олдрич	С1879-1КГ
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Leica Microsystems	ТКС SP5
CsCl	ЭМСУРА	1.02038.0100
Cs-глюконат	Самостоятельное приготовление		Так как коммерческого Cs-глюконата не было, мы готовили его сами
Д-600	Сигма-Олдрич	М5644-50МГ
Д-АПВ	Биотренд	БН0085-100
Цифровой фотоаппарат для микроскопа О	Олимп	ХМ10
ЭГТА	СЕРВА	11290.02
глюкоза	Сигма-Олдрич	49159-1КГ
ХЕПЕС	Рот	9105.2
Сильноточный изолятор стимулов	Мировые прецизионные приборы	А385
KCl	ЭМСУРА	1.04936.1000
MgCl2	ЭМСУРА	1.05833.0250
Микроманипуляторы	Луигс и Нейман	СМ7
Мироскоп	Олимп	БХ51
Монтажный материал	ThermoFisher Scientific	П36930
NaCl	Рот	3957.1
НаН2ПО4	ЭМСУРА	1.06346.1000
NaHCO3	ЭМСУРА	1.06329.1000
пипетка	Гильгенберг	1807502
съемник	Саттер	-1000
лезвие	Персонна	60-0138 (Английский
Полуавтоматический вибратом	Leica Biosystems	VT1200S
SR 95531 гидробромид	Биотренд	AOB5680-10	Антагонист ГАМК-рецепторов