Имплантация беспроводной двунаправленной микроэлектродной системы в мозг крысы

Abstract

Источник: Melo-Thomas, L., et al., Беспроводной двунаправленный интерфейс для записи in vivo и стимуляции нейронной активности у свободно ведущих себя крыс. J. Vis. Exp. (2017)

Видео демонстрирует процедуру имплантации беспроводного двунаправленного многоканального электродного блока в мозг крысы для записи и стимуляции многоканальных нейронных сетей.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Животные

1. Содержать взрослых самцов крыс Вистар (200-250 г) в группах по 3-4 человека в стандартных лабораторных условиях не менее чем за неделю до операции, чтобы обеспечить акклиматизацию.
2. Через два дня после операции домашние крысы живут парами. Накрывайте одинарные клетки высокими акриловыми крышками. Избегайте обычных крышек из металлической сетки, так как имплантаты могут застрять, что увеличивает риск их повреждения и/или нестабильности с течением времени.

2. Стереотаксическая хирургия

1. Перед началом операции организуйте и подготовьте следующее оборудование и материалы:
   1. Приобретите стерильное хирургическое оборудование, состоящее из стерильных ножниц, тупых щипцов, шпателей, хирургических машинок для стрижки, стоматологических бормашин и ватных палочек.
   2. Приобретайте лекарства и химические вещества, включая изофлуран, ксилокаин, трамадола гидрохлорид, декспантенол глазной мази, 3% перекись водорода, повидон-йод и 70% этанол.
   3. Приобретите материал для крепления, включая винты из нержавеющей стали, акриловую смолу, ультрафиолетовый клей и защиту колпачка.
   4. Получить микроэлектродный блок, состоящий из: (i) записывающего одиночного электрода (микроэлектрод из кварцевого стекла с изоляцией из платины, вольфрамовый микроэлектрод, с конической формой наконечника, внешний диаметр: 80 мкм, конический наконечник, импеданс на частоте 1 кГц: 500 кОм) или тетрода (микроэлектрод из кварцевого стекла с 4 сердечниками из платины/вольфрама, внешний диаметр: 100 мкм, конический наконечник, импеданс на частоте 1 кГц: 500-800 кОм); (ii) электрод для стимуляции (платино-иридиевая проволока (90% платины, 10% иридия), диаметр сердечника 125 мкм, наружный диаметр 150 мкм, импеданс <10 кОм), соединенный с контактной пластиной, и (iii) электрод сравнения из платиновой проволоки (диаметр вала 100 мкм; Рисунок 1А).
   5. Приобретите держатель электрода, приклеенный водорастворимым клеем к микроэлектродному блоку, и проверьте его работоспособность не менее чем за 2 ч (рис. 1B).
   6. Получите обычную привязную систему, состоящую из дифференциального предусилителя, основного усилителя и усилителя с полосовым фильтром для записи.
   7. Приобретите дополнительный материал, такой как перчатки, грелку, шприцы и физиологический раствор.
   8. Приобретите домашние клетки (Д x Ш x В: 42 см x 26 см x 38 см).
2. Процедура
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация электродов проводится во время обычной стереотаксической операции под анестезией изофлурана.
   1. Убедитесь, что экспериментатор одет в перчатки, хирургическую маску и лабораторный халат.
   2. Начните анестезию, поместив животное в индукционную камеру (изофлуран 4-5%, поток кислорода 1 л/мин, продолжительность ~5 мин).
   3. Тест на потерю рефлексов (хвостовых и пальцевых рефлексов) с помощью щипцов для подтверждения глубокой анестезии.
   4. Поместите голову животного в маску для анестезии, закрепленную вокруг верхнего резца стереотаксической рамки, и отрегулируйте анестезию (изофлуран 2-3%, поток кислорода 0,7-0,8 л/мин).
   5. Зафиксируйте и горизонтально выровняйте голову животного в стереотаксическом аппарате с помощью ушных планок и верхней планки резцов.
   6. Побрейте операционное поле с помощью хирургических машинок для стрижки или ножниц и простерилизуйте повидон-йодом.
   7. Положите животное на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение, и обработайте глаза декспантеноловой мазью для глаз, чтобы предотвратить их высыхание.
   8. Введите ксилокаин (0,3-0,4 мл, подкожно, подкожно) в центр операционного поля.
   9. Снова проведите тест на потерю рефлексов.
   10. Сделайте небольшой разрез (1,5 см) скальпелем в середине операционного поля, чтобы обнажить череп. Аккуратно отделите кожу и удалите остатки ткани с помощью щипцов, ножниц и шпателя.
   11. Тщательно очистите череп с помощью ватных палочек, покрытых перекисью водорода.
   12. Просверлите 4-5 небольших отверстий (4,7 мм) в черепе для фиксации винтов из нержавеющей стали.
   13. Подключите блок микроэлектродов/держатель электродов к предусилителю и прикрепите его к стереотаксическому микроманипулятору (рис. 1В и 1В).
   14. Просверлите отверстие (примерно 7 мм) в черепе над целевой областью, используя координаты из атласа мозга в зависимости от используемого животного. В настоящем исследовании кончики электродов, направленные на нижний холмик, расположены по следующим координатам, при этом брегма служит в качестве опорной: передний/задний, −8,8 мм; медиальный/латеральный, 1,5 мм; и дорсальный/брюшной, 3,5 мм.
   15. Впитайте любую кровь ватными палочками.
   16. Вертикально вводите микроэлектродный блок до тех пор, пока кончики электродов не достигнут целевой области.
   17. Расположите кабель заземления вдоль винтов из нержавеющей стали и под обшивкой.
   18. Отслеживайте активность спайков и тщательно корректируйте положение электродов с помощью микроманипулятора до тех пор, пока не достигнете зоны активных нейронов в структуре мишени, и обнаруживайте нейронную активность с соотношением сигнал/шум, подходящим для сортировки спайков.
   19. Закрепите микроэлектродный блок на черепе с помощью ультрафиолетового клея и покройте контактную пластину и винты акриловой смолой.
   20. Вводите физиологический раствор (1 мл внутримышечно) и трамадол (25 мг/кг, сук) для предотвращения обезвоживания и обеспечения послеоперационной анальгезии соответственно.
   21. Отсоедините блок микроэлектродов от электрододержателя с помощью щетки, смоченной в воде.
   22. Прекратите обезболивание, и осторожно извлеките крысу из стереотаксической рамки. Отсоедините предусилитель от микроэлектродного блока.
   23. Подключайте защитный колпачок на имплантированном микроэлектродном блоке и отсоединяйте его только во время экспериментальных процедур.

Results

Рисунок 1: Микроэлектродная установка TWS. (1) регистрирующий одиночный электрод/тетрод, (2) электрод для стимуляции, (3) плата для подключения волокна электрода, (4) гибкие соединительные кабели, (5) провод заземления, (6) соединительная плата, (7) штекерный или гнездовой разъем для системы TWS (A); микроэлектродный блок TWS, подключенный к предусилителю (8) и держателю (9); (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Беспроводная система Thomas (TWS) версия 2.0	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001165	Thomas Wireless System (TWS) версии 2.0 — портативная многоканальная телеметрическая система с ноутбуком, предустановленной операционной системой Microsoft Windows и управляющим программным обеспечением TWS. TWS включает в себя: малошумящий 4-канальный пред- и программируемый основной усилитель с фиксированной полосой пропускания, одноканальный стимулятор постоянного тока для подачи двухфазных импульсов тока, программируемый микростимулятор, имплантируемую систему разъемов и базовую головную сцену для установки на животное. Система поставляется с приемопередатчиком с USB-портом для подключения ноутбуков или настольных персональных компьютеров, управляющее программное обеспечение работает под управлением операционной системы Microsoft Windows. Система TWS может быть использована для внеклеточной нейронной стимуляции и регистрации у свободно ведущих себя мелких животных (например, крыс, морских свинок). Эта система может быть адаптирована для использования и на более крупных животных (например, приматах).
Программное обеспечение для Thomas Wireless System (TWS)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	включен в AN001165	Программное обеспечение для беспроводной системы Thomas работает под управлением операционной системы Microsoft Windows и предоставляет графический пользовательский интерфейс (GUI) для беспроводной системы Thomas Wireless System (TWS). Графический интерфейс TWS обеспечивает полный контроль над функциями TWS: 4-канальная запись и 1-канальная стимуляция.
Имплантируемый тетрод для записи (4 канала) и стимуляции (один канал)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001132	Имплантируемый тетрод для записи (4 канала) и стимуляции (один канал) для использования с Thomas Wireless Systems (TWS). Технические характеристики записывающего тетрода: материал волокна тетрода: платиновое вольфрамовое волокно с изоляцией из кварцевого стекла, внешний диаметр волокна тетрода: 100 мкм, форма наконечника D, импеданс 0,5-0,8 МОн; Электрод сравнения: форма наконечника: D; Импеданс: 300-500 кОм; Материал: кварцевая изоляция платина/вольфрам; Спецификация электрода для стимуляции: материал волокна: платина/иридий, диаметр: 125 мкм, изоляция лаком, форма наконечника: D, импеданс: < 10 кОм, размеры электрода могут быть указаны конечным пользователем
Имплантируемый микроэлектрод для регистрации (одноканальный) и стимуляции (одноканальный)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001118	Имплантируемый микроэлектрод для записи (одноканальный) и стимуляции (одноканальный) для использования с Thomas Wireless Systems (TWS). Технические характеристики регистрирующего электрода: материал электродного волокна: платиновое вольфрамовое волокно с изоляцией из кварцевого стекла, внешний диаметр электродного волокна: 80 мкм / 250 мкм (пожалуйста, укажите), форма наконечника D, импеданс 0,5-0,8 МОн; Электрод сравнения: форма наконечника: D; Импеданс. 300-500 кОм; Материал: кварцевая изоляция платина/вольфрам; Спецификация электрода для стимуляции: материал волокна: платина/иридий, диаметр: 125 мкм, с лаковой изоляцией, форма наконечника: D, импеданс: < 10 кОм
Держатель для имплантации электродов	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000838	Специальный изогнутый металлический стержень для имплантации микроэлектродов для стандартных электрододержателей. Стержень используется для удержания имплантируемого электрода. Имплантируемый электрод крепится к стержню с помощью специального водорастворимого клея Thomas RECORDING (AN001080). (Держатель электрода в комплект не входит)
Запасной аккумуляторный блок питания для беспроводной системы Thomas (3,7 В/230 мАч)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001208	Замена аккумуляторной батареи (аккумулятора) для беспроводной системы Thomas емкостью 230мА примерно на 1 час работы. (размер: 27 мм x 20 мм x 6 мм, вес около 6 г)
Запасной аккумуляторный блок питания для беспроводной системы Thomas (3,7 В/450 мАч)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001209	Замена аккумуляторной батареи (аккумулятора) для беспроводной системы Thomas мощностью 450мА на время работы более 1 часа. (размер: 48 мм x 30 мм x 4 мм, вес около 11 г)
Зарядное устройство для аккумулятора Thomas Wireless System (TWS)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001207	Зарядное устройство с питанием от сети для аккумуляторных батарей Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 и AN001209)
Водорастворимый клей	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001080	Водорастворимый электродный клей Thomas RECORDING является специально подобранным продуктом для использования с имплантируемыми микроэлектродами в нейронаучных исследованиях. Его уникальные свойства обеспечивают жесткое соединение между электродом и монтажным устройством, хотя он легко снимается теплой водой. Водорастворимый электродный клей Thomas RECORDING можно использовать в готовом виде, без какой-либо трудоемкой подготовки. Водорастворимый электродный клей Thomas RECORDING не вреден для человека, животных и окружающей среды. Количество: 1 коробка по 10 грамм
Миниатюрный дифференциальный предусилитель	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000329	Миниатюрный дифференциальный предусилитель, модель MDPA-2 - это двухканальный предусилитель с дифференциальным входом, предназначенный для записи с низким уровнем шума из возбудимых тканей. Он предназначен для внеклеточной регистрации в сочетании с имплантацией имплантируемых микроэлектродов для свободно движущихся животных приложений с помощью беспроводной системы Томаса (TWS). 2-канальный миниатюрный дифференциальный предусилитель (MDPA-2) подключается к имплантируемым микроэлектродам для обеспечения начального десятикратного каскада усиления. В идеале для получения оптимальных результатов записи с высокой амплитудой сигнала и низким уровнем шума используются платиновые/вольфрамовые электроды Thomas RECORDING с изоляцией из кварцевого стекла. MDPA-2 имеет дополнительные входы для заземляющих электродов и электродов сравнения.
Соединительный кабель	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000330	Соединительный кабель для подключения миниатюрного дифференциального предусилителя Томаса (MDPA-2) к основному усилителю и источнику питания аккумулятора.
Аккумуляторный блок питания для миниатюрного предусилителя	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000328	Аккумуляторный блок питания для миниатюрного дифференциального предусилителя (MDPA-2).
Зарядное устройство для аккумулятора (US)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000167	Аккумуляторное зарядное устройство для AN000328 блока питания (сетевой разъем питания США)
Зарядное устройство для аккумулятора (EU)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000168	Зарядное устройство аккумулятора для AN000328 питания (разъем сетевой розетки ЕС)
Дифференциальный предусилитель/основной усилитель/полосовой фильтр	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000677	Основной усилитель переменного тока TREC (LabAmp-03) — это одноканальный дифференциальный главный усилитель для нейрофизиологических применений (например, для внеклеточной записи с помощью микроэлектродов). Этот прибор предназначен для работы с миниатюрным дифференциальным предусилителем модели MDPA-2. Один канал LabAmp-03 содержит каскад дифференциального усилителя с высоким коэффициентом усиления и низким уровнем шума, за которым следуют фильтры низких частот и высокочастотных фильтров. Усилитель имеет два различных фильтрующих усилителя, фильтр-усилитель с одним блоком активности (SUA) и фильтрующий усилитель с локальным потенциалом поля (LFP), оба соединены параллельно в сигнальном тракте. Режим записи предлагает два уровня усиления сигнала (x10, x100) в первом каскаде и 4 дополнительных уровня (x5, x10, x25 и x50) в конечном каскаде усилителя. Каждый усилитель имеет различные полосовые характеристики для одиночной активности блока (SUA) 500 Гц...20 кГц и потенциалов локального поля (LFP) 0,1 Гц...140 Гц. В устройство встроен аудиомонитор и оконный дискриминатор. LabAmp-03 имеет встроенный аудиомонитор с громкоговорителем. Данное устройство обеспечивает воспроизведение звука электрофизиологических сигналов. Устройство сочетает в себе усилитель звука в компактном, прочном корпусе. Это особенно подходит для мониторинга нейронных импульсов и мышечных сокращений. Вход аудиомонитора внутренне подключен к выходу усилителя SUA-Filter. LabAmp-03 поставляется с внешним источником питания для диапазона рабочего напряжения сети 100-240 В переменного тока/50-60 Гц.
USB-осциллограф	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Этот 2-канальный осциллограф для ПК идеально подходит для мобильного использования на ноутбуке и стационарной установки в шкафах управления, промышленном оборудовании и многих других приложениях, где требуется небольшой, легкий и мощный осциллограф. Этот осциллограф подключается к сигнальному выходу основного усилителя для отображения регистрируемой внеклеточной активности во время планирования имплантируемых микроэлектродов для беспроводной системы Томаса (TWS). Пользователь может получать данные измерений по нескольким информационным интерфейсам непосредственно на ПК с помощью прилагаемого программного обеспечения для ПК.
Генератор стимулов	Многоканальные системы	STG3008-FA	Генератор стимулов для тока (STG) и стимуляция под напряжением выполняют три функции: стимуляция током, стимуляция напряжением, управление и синхронизация. STG доступен с 2, 4 или 8 независимыми выходными каналами. Благодаря встроенным блокам изоляции для каждого выходного канала STG может выдавать сигналы произвольной формы.
Протектор колпачка для электрода	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN001193	Защитный колпачок для имплантируемого электродного блока для беспроводной системы Thomas
Хирургическое оборудование			Ножницы, тупые щипцы, шпатели, хирургические кусачки, бормашины для зубов и ватные палочки
Лекарства и химикаты			изофлуран, ксилокаин, трамадола гидрохлорид (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ульм, Германия), декспантеноловая глазная мазь (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Германия), 3% перекись водорода, повидон-йод (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Германия) и 70% этанол;
Фиксирующий материал, в том числе			Винты из нержавеющей стали (BN650 M1.2x5; 4,7 мм), акриловая смола (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Ханау, Германия), ультрафиолетовый клей (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Германия) и протектор колпачка (Thomas Recording GmbH, Гиссен, Германия);
Дополнительный материал			Перчатки, грелка, шприцы и физиологический раствор.
Стереотаксический инструмент для мелких животных (SASI)	Томас РЕКОРДИНГ ГмбХ	AN000287	Модель следует выбирать в соответствии с животным (крысой, морской свинкой, обезьянами и т.д.), используемым в исследовании
видеокамера	ЭверФокус		EverFocus, модель: EQ150