Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Решения для острой записи срезов
- Перед электрофизиологическими экспериментами приготовьте стоковые растворы 10-кратного раствора искусственной спинномозговой жидкости (124 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO3, 1 мМ2PO4 и 11 мМ D-глюкозы). Хранить раствор при температуре 4 °C в бутылке объемом 1 л без CaCl2 и MgCl2.
- Приготовьте раствор пипетки на основе глюконата калия, содержащий 135 мМ K-глюконат, 1,2 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 0,2 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2, 4 мМ MgATP, 0,4 мМ Tris-GTP, 10 мМ Na 2-фосфокреатин и 2,7–7,1 мМ биоцитин для последующего выявления морфологии клеток. Отрегулируйте pH раствора до 7,3 и осмолярность до 290 мОсм. Хранить 1 мл аликвот при температуре -20 °C.
2. Запись патч-хомута всей клетки
- Аккуратно перенесите срез мозга, содержащий комплекс гиппокампа, с помощью изготовленной на заказ стеклянной передаточной пипетки в записывающую камеру, установленную на вертикальном микроскопе. Трансферная пипетка состоит из укороченной пастеровской пипетки (внутренний диаметр 6,5 мм), прикрепленной к резиновой колбе для пипетки. Непрерывно перфузируйте записывающую камеру (3 мл) с температурой 34 °C (подогретая) с пузырьками 95%/5%O2/CO2. Установите скорость работы перистальтического насоса на 2-3 мл/мин.
- Кратко изучите экспрессию Chronos-GFP в терминалах аксонов в исследуемой области с синим светодиодным освещением (470 нм) и наблюдайте с помощью объектива 4x. Флуоресценция GFP визуализируется с помощью соответствующего эмиссионного фильтра, а изображение с ПЗС-камеры выводится на экран компьютера.
- Для его поддержания поместите на срез якорь, изготовленный из U-образной платиновой проволоки с плотно расположенными нейлоновыми струнами («арфа»).
- Переключитесь на объектив с 63-кратным погружением и отрегулируйте фокус. Проверьте наличие аксонов, экспрессирующих Chronos-GFP, и выберите пирамидальный нейрон для патч-записи.
- Переместите цель вверх.
- Вытягивайте пипетки с помощью съемника электродов Brown-Flaming из боросиликатного стекла. Съемник предназначен для производства пипеток с диаметром наконечника около 1 мкм. Заполните пипетки внутренним раствором на основе K-глюконата.
- Установите пипетку в держатель пипетки на ведущем столе. Опустите пипетку в камеру и найдите наконечник под объективом. Сопротивление пипетки должно быть в пределах 3–8 МОм. Приложите шприц к легкому положительному надавливанию так, чтобы увидеть, как конус раствора вытекает из пипетки, и постепенно опускайте пипетку и объектив к поверхности среза.
- Заплатите ячейку в конфигурацию вольт-хомута: подойдите к идентифицированному нейрону и деликатно прижмите наконечник пипетки к соме. Положительное давление должно давать ямочку на поверхности мембраны. Ослабьте давление, чтобы создать гигаомное уплотнение (сопротивление >1 ГОм). После герметизации установите напряжение удержания на -65 мВ. Разорвите мембрану резким импульсом отрицательного давления: это достигается за счет приложения сильного отсоса к трубке, подключенной к держателю пипетки.
- Запишите в режиме зажима тока всей клетки реакцию нейрона на шаги гиперполяризующего и деполяризующего тока (рис. 1A).
заметка: Этот протокол будет использоваться для определения активных и пассивных внутренних свойств клетки. Специально написанные процедуры MATLAB используются для анализа в автономном режиме.
- Запись постсинаптических реакций в токе или напряжении клещей на светодиодную стимуляцию афферентных волокон с длиной волны 475 нм во всем поле, экспрессирующих Chronos. Стимулируйте сериями из 10 стимуляций длительностью 2 мс с частотой 20 Гц (рис. 1, B, C). Интенсивность света может варьироваться от 0,1–2 мВт.<бр/>
заметка: Интенсивность света измерялась с помощью цифровой портативной оптической консоли, оснащенной фотодиодным датчиком, расположенным под объективом. Для моносинаптического соединения характерны задержки отклика в 2–4 мс.
