Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Подготовка аппаратного и программного обеспечения для многоканальной записи
- Настройте 16-канальную систему сбора данных в соответствии с инструкциями производителя.
заметка: Для сбора многоканальных записей можно использовать несколько коммерчески доступных усилителей и систем сбора данных. В описанных здесь экспериментах аналоговые сигналы подаются через электродную эталонную панель на два усилителя, где они усиливаются (в 2000 раз) и фильтруются (0,1-10 кГц). Аналоговые входы в систему сбора данных оцифровываются с частотой 40 кГц.
- Закрепите соответствующий 16-канальный адаптер головного столика к микроманипулятору микроскопа. Расположите адаптер так, чтобы гнездовые порты разъема были направлены вниз.
- Отрегулируйте угол работы этого микроманипулятора таким образом, чтобы он был ориентирован вниз к записывающей камере под углом примерно 70° относительно горизонтали.
- Подключите вход головного стола к датчику 16 x 1 для электрофизиологии in vitro через адаптер головного столика, закрепленный на микроманипуляторе.
- Подключите выходной разъем головного каскада к системе сбора данных.
- Установите соответствующее программное обеспечение для сбора данных. Настройте 15 входных каналов в соответствии с входными сигналами от первых 15 многоканальных контактов пробника. Настройте оставшийся канал для приема входных данных от внутриклеточного электрода.
заметка: При сборе и анализе данных внимательно следите за картами электродов и адаптеров, чтобы убедиться, что соответствующий сигнал соответствует контакту электрода, с которого он был собран.
2. Настройка протоколов световой стимуляции
- Настройте систему доставки света и установите сопутствующее программное обеспечение.
- Откройте программу. Выберите конфигурацию аппаратной проводки, в которой источник запуска (цифровой/TTL (транзисторно-транзисторная логика) выход) подает сигнал запуска на систему подачи света, а система подачи света подает сигнал на выход запуска на светодиод с длиной волны 470 нм (светоизлучающий диод).
- Установите объектив большой мощности. С помощью цифровой камеры можно откалибровать объективы высокой мощности с помощью системы подачи света.
- Создайте новую последовательность профилей световой стимуляции.
- Создайте шаблон по выбору. В описанных здесь экспериментах круг диаметром 150 мкм позволяет активировать окончания аксонов послойно-специфично.
- Чтобы создать последовательность профилей, скопируйте и вставьте этот профиль для каждого из любого числа испытаний.
- Создайте список осциллограмм, содержащий осциллограммы любой интенсивности, длительности или количества импульсов.
- Случайным образом назначайте осциллограммы каждому профилю. Каждый профиль с назначенной ему формой сигнала соответствует одному импульсу запуска с цифрового входа TTL или одному испытанию.
- Сохраните последовательность профилей.
- В программном обеспечении для сбора данных создайте новый протокол.
- Установите количество попыток равным количеству профилей в созданной последовательности профилей.
- Выберите входы сигнала в соответствии с настроенными на шаге 1.6. Настройте протокол, который обеспечивает один цифровой выход TTL, записывая данные с этих 16 входных каналов в течение соответствующего периода времени до и после цифрового запуска.
3. Установка многоканального зонда в срез ткани мозга ex vivo
- Перфузионная пузырьковая eACSF (экспериментальная искусственная спинномозговая жидкость) (не в герметичных пакетах) со скоростью 3-6 мл/мин.
- Перенесите срез мозга, содержащий интересующую область, на сетку сетки в перфузионной камере микроскопа. Якорь с платиновой арфой
- Поверните сетку сетки таким образом, чтобы линия контактов электродов на дистальном конце многоканального зонда была примерно перпендикулярна поверхности пиала.
- Опустите многоканальный щуп к поверхности среза под широкоугольным освещением и точным контролем микроманипулятора.
- Поверните революцию куба фильтра, чтобы зацепить соответствующий куб фильтра, чтобы визуализировать флуоресцентный репортерный белок, экспрессируемый в окончаниях аксонов корковых афферентов. При необходимости поверните срез, чтобы более точно выровнять щуп с поверхностью пиала.
- Расположите зонд чуть выше плоскости среза, на расстоянии ~200 мкм от конечного целевого положения по оси x, оставив по крайней мере один канал за пределами регистрируемой области ткани.
- Медленно введите щуп в срез, перемещая манипулятор вдоль его продольной оси. Чтобы свести к минимуму повреждение тканей, продвигайте зонд только до такой степени, чтобы острые кончики были видны только ниже поверхности ткани. Это сведет к минимуму повреждение тканей, обеспечивая при этом контакт электродов с тканью.
4. Патч зажимает целевые нейроны и получает конфигурацию всей клетки
- Переключите источник eACSF на решение baged Control.
- Идентификация флуоресцентно меченых клеток для целевой записи с помощью патч-клэмпа.
- Ограничьте отверстие ирисовой диафрагмы до наименьшего диаметра. Включите маломощную линзу объектива и сфокусируйте ткань.
- Центрируйте свет над участком ткани, прилегающим к многоканальному зонду (но не перекрывающимся).
- Включите мощный (40-кратный или 60-кратный) погружной объектив с осторожностью, чтобы избежать контакта между многоканальным зондом и линзой объектива.
- Поверните революцию куба фильтра, чтобы включить соответствующий набор фильтров для визуализации клеток, экспрессирующих Cre-зависимый флуоресцентный маркер.
- Определите флуоресцентно меченую клетку в качестве мишени для записи с помощью патч-клэмпа. Поднимите линзу объектива, чтобы освободить достаточно места для опускания патч-пипетки.
- Загрузите патч-пипетку (см. таблицу 1) с внутренним раствором (таблица 2) и установите пипетку в держатель электрода. Используя шприц объемом 1 мл, приложите положительное давление, соответствующее ~0,1 мл воздуха.
- Опустите патч-пипетку в раствор. Сфокусируйте наконечник пипетки под визуальным контролем.
- Получите запись всей клетки из целевой клетки, используя шаги, продемонстрированные ранее33.
- Если вы планируете оценить изменения внутренних свойств ячейки (например, входного сопротивления, скорости срабатывания потенциала действия в ответ на текущие шаги), проведите эти записи. В противном случае перейдите к протоколу стимуляции аксонов, приведенному ниже.
Таблица 1: Состав искусственной спинномозговой жидкости и внутриклеточного раствора. Перечислены реагенты и концентрации для eACSF, а также раствор для внутриклеточной пипетки для записи с помощью пластыря.
См.
См.
См.
| Эксперимент ACSF, eACSF (в мМ) |
| NaCl | 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| ХЕПЕС | 20 |
| KCl | 1.8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| MgSO4 | 1.4 |
| КХ2ПО4 | 1.2 |
| глюкоза | 10 |
| Внутреннее решение |
| К-глюконат | 140 |
| NaCl | 10 |
| ХЕПЕС | 10 |
| ЭГТА | 0,1 |
| МгАТФ | 4 |
| НаГТП | 0,3 |
| рН = 7,2 |
