Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Предоперационная подготовка
- Приготовление электродного раствора
- Чтобы сделать раствор для засыпки электрода, приготовьте раствор из 4 М ацетата калия с 140 мМ хлорида калия.
- Подготовка электродов
- С помощью вакуумного отсоса вставить углеродное волокно Т-650 (диаметр 7 мкм) в капилляр из боросиликатного стекла (длина = 100 мм, диаметр = 1,0 мм, внутренний диаметр = 0,5 мм).
- После того, как углеродное волокно будет помещено внутрь стеклянного капилляра, поместите стеклянный капилляр в вертикальный электродный съемник так, чтобы нагревательный элемент находился примерно посередине капилляра. Установите обогреватель на 55 при выключенном магните.
- После того как капилляр будет оттянут, осторожно поднимите верхний капилляродержатель так, чтобы кончик электрода не был окружен нагревательным элементом.
- С помощью острых ножниц разрежьте углеродное волокно, которое еще соединяет две части капилляра. В результате получится два отдельных микроэлектрода из углеродного волокна.
- Под световым микроскопом осторожно разрежьте острым скальпелем обнаженное углеродное волокно так, чтобы оно выходило примерно на 75-100 мкм за торец стекла.
- С помощью светового микроскопа убедитесь, что электрод не имеет трещин вдоль капилляра, а уплотнение, где углеродное волокно выходит из капилляра, трудно заметить и не имеет трещин.
заметка: Хорошее уплотнение поможет снизить шум во время записи.
- Изготовление электродов сравнения
- Припаяйте золотую булавку к серебряной проволоке диаметром 5 см.
- Прикрепите анод к металлической скрепке или другому проводнику, катод к штырю и подайте напряжение (~2 В), пока скрепка и серебряная проволока погружены в 0,1 М HCl.
- Выключите напряжение, как только на серебряной проволоке появится белый налет (AgCl).
- Подготовка электродов к имплантации
- Припаяйте золотой штырь к тонкому изолированному проводу (~10 см в длину, <0,50 мм в диаметре).
- Снимите ~5 см изоляции с провода, противоположного золотому штифту.
- Заполните электрод раствором электрода примерно наполовину.
- Вставьте изолированный провод в электрод.<бр />
заметка: Провод должен соприкасаться с углеродным волокном внутри электрода.
2. Имплантация электродов
- Взрослым, самцам, крысам Sprague Dawley (250−450 г) вводят внутрибрюшинную инъекцию (1,5 г/кг или 1 мл/кг объема) 0,5 г/мл уретана, растворенного в стерильном физрастворе. Начните с начальной уретановой дозы 1,0−1,2 г/кг. Если животное все еще реагирует на тест на вредный стимул (щипывание хвоста) через 20 мин после введения уретана, введите дополнительно 0,3−0,5 г/кг уретана в общей дозе 1,5 г/кг.
заметка: Чтобы приготовить раствор уретана в концентрации 0,5 г/мл, добавьте 10 г уретана к 10 г (~10 мл) физиологического раствора. Уретан является канцерогеном, и с ним нужно обращаться осторожно. Тем не менее, это важный анестетик, так как он не изменяет уровень дофамина, как другие анестетики, такие как кетамин/ксилазин и хлоралгидрат.
- Как только животное будет глубоко обезболено и перестанет реагировать на вредные раздражители (например, защемление пальца ноги), поместите его в стереотаксическую рамку. Нанесите офтальмологическую смазку на каждый глаз крысы.
заметка: Это операция, не требующая выживания, но рекомендуется использовать хорошую асептическую технику.
- Очистите кожу головы крысы с помощью двухступенчатого скраба (т.е. скраба с йодоповидоном, за которым следует скраб с 70% этанолом; выполните с 3-х циклическим повторением).
- Отрежьте ткань кожи головы с помощью стерилизованного игольчатого пинцета для носа и хирургических ножниц. Удалите значительное количество ткани, чтобы освободить место для различных имплантаций, описанных ниже.
- Аккуратно очистите поверхность черепа с помощью стерилизованных ватных аппликаторов. Затем нанесите 2−3 капли 3%-ной перекиси водорода, чтобы помочь выявить лямбду и брегму.
- С помощью стереотаксической или ручной дрели (1,0 мм, ~20 000 об/мин) просверлите отверстие диаметром 1,5 мм на 2,5 мм впереди брегмы и на 3,5 мм сбоку от брегмы. Частично (примерно наполовину, пока он не будет прочно вживлен) вживите в это отверстие винт (наружный диаметр 1,59 мм, длина 3,2 мм). Рекомендуется использовать стерильный физиологический раствор для орошения во время сверления, чтобы предотвратить термическую травму.
- Для электрода сравнения просверлите отверстие диаметром 1,0 мм на 1,5 мм спереди и на 3,5 мм латеральнее брегмы, в левом полушарии.
- Вручную вставьте ~2 мм контрольного провода в это отверстие, одновременно оборачивая эталонный провод вокруг и под головкой имплантированного винта.
- Полностью имплантируйте винт, закрепив электрод сравнения на месте.
- В правом полушарии просверлите отверстие диаметром 1,5 мм на 1,2 мм спереди и на 1,4 мм сбоку от брегмы.
- Аккуратно удалите твердую мозговую оболочку с помощью пинцета.
- Для стимулирующего электрода просверлите квадратное отверстие (2 мм спереди-сзади, 5 мм медиально-латеральное) с центром на 5,2 мм сзади и на 1,0 мм латеральнее брегмы.
- С помощью стереотаксических дуг опустите биполярный стимулирующий электрод/направляющую канюлю на 5 мм ниже твердой мозговой оболочки. В случае кровотечения во время имплантации электрода используйте стерильные ватные палочки и марлю, чтобы свести к минимуму кровотечение><.
заметка: Биполярный стимулирующий электрод, используемый в этом методе, предварительно оснащен направляющей канюлей (Таблица материалов). Внутренняя канюля, используемая с этим элементом, должна быть промыта зубцами на биполярном стимулирующем электроде при полной установке в направляющую канюлю. Это позволит внутренней канюле располагаться непосредственно между двумя контактами стимулятора, которые находятся на расстоянии около 1 мм друг от друга. Аналогичный протокол описан в другом месте.
- С помощью стереотаксических дуг опустите микроэлектрод из углеродного волокна на 4 мм ниже твердой мозговой оболочки. Это место находится в самой дорсальной части стриатума.
- Подключите контрольный провод и углеродное волокно к потенциостату.
- Подача треугольного сигнала (-0,4−1,3 В, 400 В/с) в течение 15 мин при частоте 60 Гц, а затем в течение 10 мин при частоте 10 Гц.<бр/>
заметка: Как правило, при нанесении волновых форм на микроэлектроды из углеродного волокна в мозге оксидные группы добавляются на поверхность углеродного волокна. Равновесие этой реакции должно быть достигнуто до начала регистрации; В противном случае произойдет значительный дрейф19. Циклическое вращение электрода на более высоких частотах (60 Гц) позволяет углеродному волокну быстрее достигать равновесия.
3. Оптимизация углеродного волокна и стимуляция расположения электродов/направляющих канюль
- Настройте стимулятор на получение биполярной электрической волны с частотой 60 Гц, 24 импульсами, током 300 мкА и длительностью импульса 2 мс/фаза.
- Осторожно опустите стимулятор с шагом 0,2 мм от 5 мм до 7,8 мм ниже твердой мозговой оболочки. При каждом приращении стимулируйте VTA.
заметка: На большей глубине спины (5−6 мм) стимуляция мозга обычно (~80% времени) вызывает подергивание усов крысы. На большей глубине усы перестают подергиваться, что происходит на 7,5−8,2 мм ниже твердой мозговой оболочки. Когда усы перестанут подергиваться, стимулирующий электрод будет находиться рядом или на ВТА. Это происходит не у каждой крысы, и отсутствие подергивания усов не следует воспринимать как признак того, что биполярный стимулирующий электрод/инфузионная канюля неправильно расположены. Подергивание усов может возникать не для всех анестетиков (например, изофлурана).
- Продолжайте опускать биполярный стимулирующий электрод/направляющую канюлю до тех пор, пока стимуляция не приведет к фазовому высвобождению DA на микроэлектроде из углеродного волокна (в настоящее время в дорсальном стриатуме).
заметка: Высвобождение DA в дорсальном стриатуме не всегда происходит, если биполярный электрод имплантирован в VTA, но наблюдение за высвобождением DA в дорсальном стриатуме при стимуляции VTA обычно является хорошим признаком того, что в ядре NAc будет наблюдаться хороший сигнал.
- Опустите микроэлектрод из углеродного волокна до тех пор, пока он не окажется хотя бы на 6,0 мм ниже твердой мозговой оболочки. Это самая дорсальная часть ядра NAc.
- Стимулируйте VTA и запишите пиковую амплитуду пика DA.
- Опустите или поднимите микроэлектрод из углеродного волокна в месте, где происходит наибольшее высвобождение DA.
- Убедитесь, что пик отклика DA имеет четкий пик окисления при 0,6 В и пик восстановления при -0,2 В. Эти пики указывают на DA.
4. Запись комбинированной инфузии и стимуляции FSCV
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показана временная шкала регистрации до и после микроинфузии VTA.
- После того, как углеродное волокно и расположение стимулирующего электрода/направляющей канюли будут оптимизированы, стимулируйте в течение ~20−30 мин.<бр/>
заметка: При текущих параметрах стимуляции не стимулируйте чаще одного раза в 3 минуты, чтобы обеспечить везикулярную перезагрузку22.
- После достижения стабильного исходного уровня (изменение <20% в течение пяти стимуляций) осторожно опустите внутреннюю канюлю вручную в направляющую канюлю, которая предварительно установлена в биполярный стимулятор.
- Сделайте еще 2−3 базовые записи, чтобы убедиться, что введение канюли само по себе не изменило вызванный сигнал. В некоторых случаях введение и удаление внутренней канюли может привести к повреждению ВТА. Если за этот базовый период сигнал резко изменится (>20%), то сделайте еще 3−4 записи, пока базовый уровень не стабилизируется.
- С помощью шприцевого насоса и микрошприца введите 0,5 мкл раствора (например, 0,9% физиологического раствора, N-метил-D-аспартата [NMDA], (2R)-амино-5-фосфоновалеровой кислоты [AP5]) в ВТА в течение 2 минут.
- После инфузии оставьте внутреннюю канюлю не менее чем за 1 минуту до удаления.
заметка: Некоторые препараты могут потребовать оставления внутренней канюли на более длительное время в зависимости от кинетики препарата, и удаление внутренней канюли может привести к тому, что лекарство будет перемещаться обратно по внутренней канюле. Если есть опасения, можно оставить внутреннюю канюлю в направляющей канюле на протяжении всей записи. В противном случае запись может начаться после этого интервала в 1 минуту.
- Продолжайте запись каждые 3 минуты, чтобы измерить эффект после инфузии.
заметка: Если при вливании контрольного раствора эффекта не наблюдается, можно ввести второй раз10. Если происходит изменение высвобождения DA, вызванное введением внутренней канюли или инфузией физиологического раствора, сигнал обычно восстанавливается до исходного уровня в течение 30 минут.
