Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Герметизация ячеек для записи
- Перед началом записи убедитесь, что все элементы оборудования (микроскоп, усилитель, дигитайзер, микроманипулятор и другие) включены.
- Заполните записывающую камеру, от коммерческой марки (Table of Materials), прикрепите к микроскопу с раствором aCSF для записи. Используйте перфузионный насос для постоянной перфузии ФКСФ со скоростью 2 мл/мин.
- Перенесите интересующий вас срез мозга (по одному) в записывающую камеру. Используйте акриловую переводную пипетку (перевернутую стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к силиконовой соске) для переноса срезов гипоталамуса в камеру. Используйте якорь для среза (Table of Materials) для удержания среза, чтобы он не двигался во время перфузии aCSF.
- Поместите срез в центр записывающей камеры, прикрепленной к микроскопу. Положение среза имеет решающее значение для обеспечения хорошего обзора нужной области под микроскопом и для идеальной досягаемости записывающей микропипетки.
- Используйте маломощный объектив иммерсионного микроскопа (10x или 20x), чтобы помочь позиционировать срез и определить интересующую область.
- После определения местоположения интересующей области переключите линзу объектива на мощную линзу (63x) и сосредоточьтесь на уровне тканей, наблюдая за эндогенным флуоресцентным белком и формами клеток в целевой области, чтобы найти клетки кисспептина на поверхности среза мозга.
- Когда возможная целевая ячейка найдена, отметьте ее на экране компьютера курсором мыши или нарисовав формат, например, квадрат, над интересующей областью. Метка на экране компьютера помогает направлять положение записывающей микропипетки к ячейке.
- После определения точного местоположения целевой ячейки поднимите объектив и введите в него записывающую микропипетку, наполненную внутренним раствором. При помещении микропипетки в держатель электродов убедитесь, что внутренний раствор находится в контакте с серебряным электродом.
заметка: Для подготовки, размещения и позиционирования микропипеток на держателе электрода.
- Перед погружением микропипетки в раствор aCSF, чтобы предотвратить попадание мусора в микропипетку, с помощью наполненного воздухом шприца объемом 1-3 мл, соединенного с держателем микропипетки через полиэтиленовую трубку (на ≈130 см длиннее), подайте около 100-200 мкл воздуха.
- С помощью микроманипулятора направьте микропипетку ниже центра объектива. Переместите кнопки на микроманипуляторе, чтобы направить микропипетку по оси X-Y-Z к интересующей клетке.
- Отрегулируйте фокус так, чтобы был виден кончик микропипетки, и приблизьте фокус к срезу, но не слишком близко. Уменьшите скорость работы микроманипулятора и медленно опускайте микропипетку в плоскость фокусировки. Убедитесь, что наконечник микропипетки не проникает резко в срез, а медленно опускается до тех пор, пока не коснется поверхности клетки/целевой области.
- Подайте легкое положительное давление (≈100 μл) с помощью наполненного воздухом шприца объемом 1–3 мл, прикрепленного к держателю микропипетки, чтобы удалить любой мусор с пути приближения.
- Сфокусируйтесь на целевой клетке и медленно перемещайте микроманипулятор по оси X-Y-Z, чтобы приблизить микропипетку к ней. При прикосновении микропипетки к клетке будет наблюдаться ямочка, вызванная давлением, приложенным через наконечник микропипетки (Рисунок 2C).
- После образования углубления, из-за близости микропипетки к клетке, нанесите слабое, кратковременное отсасывание ртом (1-2 с) через трубку, соединенную с держателем микропипетки, чтобы создать уплотнение между микропипеткой и клеткой (гигаомное уплотнение или гигауплотнение >1 ГОм; Рисунок 2D). Чтобы сформировать уплотнение, используйте режим voltage-clamp в программном обеспечении.
- Если уплотнение остается стабильным (гигаомное уплотнение должно быть механически устойчивым и без шумовых помех, определяемых наблюдением в течение примерно 1 мин), установите удерживающее напряжение на ближайший физиологический потенциал покоя исследуемой клетки. Для нейронов кисспептина гипоталамуса рекомендуется -50 мВ.
- Нанесите кратковременное отсасывание через рот (отрицательное давление) с микропипеткой, припечатанной к клетке, чтобы разорвать плазматическую мембрану (рисунок 2E). Адекватная конфигурация всей клетки достигается, когда отсасывание выполняется с достаточной силой, чтобы разорванная мембрана не закупоривала микропипетку и не притягивала значительную часть мембраны или даже клетки.
- Проверьте используемое руководство по настройкам системы. Используйте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для цифровой проверки и расчета последовательного сопротивления (SR) и емкости всей ячейки (WCC).
- В режиме напряжения-зажима, после разрыва мембраны ячейки, включите опцию «Вся ячейка» и нажмите на команду «Авто», относящуюся к вкладке «Вся ячейка». SR и wcc ячейки будут автоматически рассчитаны и мгновенно отображены программным обеспечением. Эти параметры также можно проверить, выполнив испытание мембраны с усилителем, указанным в Таблице материалов.
- Обязательно проверьте параметры жизнеспособности клеток. Для нейронов кисспептина убедитесь, что электрофизиологические измерения: SR < 25 мОм, входное сопротивление > 0,3 ГОм и абсолютное значение удерживаемого тока < 30 пА. Среднее значение WCC нейронов AVPV/PeNKisspeptin или ARHkisspeptin составляет ≈ 10-12 pF у мышей с интактными гонадами.
- Контролируйте SR и стационарную емкость ячейки во время экспериментов. Убедитесь, что SR не изменяется более чем на 20% во время записи и что емкость мембраны стабильна.
- Проверьте настройки программного обеспечения. Создайте конкретные протоколы для записей в соответствии с типом эксперимента. Для регистрации мембранного потенциала в режиме токо-зажима с помощью оборудования, указанного в Таблице материалов, отфильтруйте низкочастотные электрофизиологические сигналы на частоте 2-4 кГц и проанализируйте результаты в автономном режиме в программном обеспечении (информацию о программном обеспечении см. в Таблице материалов).
- После того, как конфигурация всей ячейки будет правильно достигнута, измерьте синаптические токи в режиме напряжения-зажима (рис. 2G). Регистрация изменений мембранного потенциала покоя (RMP) и индуцированных вариаций RMP в режиме тока-зажима (рис. 2H). Изменения RMP, такие как деполяризация клеточной мембраны, могут быть вызваны введением известного лекарственного препарата/нейромедиатора в ванну (описано в шаге 1.2), как показано на рисунке 1.
заметка: В режиме токоизмерительных клещей может подаваться положительный или отрицательный ток для поддержания напряжения мембраны на желаемом уровне. Для нейронов кисспептина мы обычно устанавливаем нулевую инжекцию тока (I = 0), чтобы зарегистрировать спонтанное изменение мембранного потенциала.
