Оценка нейронных сетей в срезах спинного мозга мышей на основе микроэлектродной матрицы

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Электрофизиология in vitro

1. Приготовление растворов для подготовки и записи срезов спинного мозга
   1. Искусственная спинномозговая жидкость
      заметка: Искусственная спинномозговая жидкость (КСФ) используется в интерфейсной инкубационной камере, где срезы хранятся до начала записи и во время экспериментов в качестве перфузата и разбавителя для лекарственных препаратов. Подробный состав см. в таблице 1.
2. Приготовьте aCSF, содержащую (в мМ) 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 глюкозу, 2,5 KCl, 1₂PO₄, 1 MgCl₂ и 2,5 CaCl₂, добавив необходимые количества вышеуказанного, исключая CaCl₂, в 2 л дистиллированной воды.
3. Пузырите вышеуказанный раствор карбогеном (95% O₂, 5% CO₂) в течение 5 минут и добавьте CaCl₂,< бр /> заметка: Этот шаг предотвращает выпадение CaCl₂, т. е. раствор не должен мутнеть. Для применения препарата во время экспериментов разбавляйте исходные растворы препарата в аКСФ до желаемых конечных концентраций.

2. Искусственная спинномозговая жидкость, замещенная сахарозой

ПРИМЕЧАНИЕ: Сахарозазамещенный aCSF используется во время рассечения и разрезания спинного мозга. Как следует из названия, сахароза является заменителем NaCl для снижения возбуждения нейронов во время этих процедур при сохранении осмолярности. Подробный состав см. в таблице 1.

1. Приготовьте сахарозозамещенную aCSF, содержащую (в мМ) 250 сахарозы, 25 NaHCO₃, 10 глюкозу, 2,5 KCl, 1₂PO₄, 1 MgCl₂ и 2,5 CaCl₂, добавив необходимые количества всех вышеперечисленных веществ, исключая CaCl₂, в 300 мл дистиллированной воды.
2. Пузырите раствор с карбогеном в течение 5 минут, а затем добавьте CaCl₂.
3. Храните раствор в морозильной камере при температуре -80 °C в течение примерно 40 минут или до тех пор, пока раствор не образует кашицу. Избегайте замерзания и используйте в консистенции кашицы.

3. Подготовка микроэлектродной матрицы

ПРИМЕЧАНИЕ: Контактная поверхность MEA требует предварительной обработки, чтобы сделать ее гидрофильной.

1. Перед экспериментом хорошо заполните MEA либо фетальной бычьей сывороткой (FBS), либо лошадиной сывороткой (HS) в течение 30 минут.
2. Удалите FBS или HS и тщательно промойте MEA примерно пятью промывками дистиллированной воды, пока дистиллированная вода не перестанет пениться. Заполните лунку кислотномозговой жидкостью, готовой к использованию.

4. Подготовка острого разреза спинного мозга

1. Глубоко обезболите мышь 100 мг/кг кетамина (внутримышечно), а затем обезглавьте ее с помощью больших хирургических ножниц.
2. Снимите кожу над областью живота, сделав небольшой надрез на коже на уровне бедер. Натягивайте кожу по обе стороны разреза рострально до тех пор, пока не будет удалена вся кожа, т. е. от верхней части грудной клетки до верхней части таза (как вентрально, так и дорсально).
3. Положите тело на лед и используйте вентральный доступ, чтобы обнажить позвоночный столб, удалив все внутренности и разрезав ребра латерально к грудине
.
4. Удалите брюшную грудную клетку, обе лопатки (отрезанные примерно в Т2), а также нижние конечности и таз (отрезанные примерно в верхней части крестца).
5. Перенесите подготовку позвоночного столба и ребер в рассекающую ванну, содержащую ледяную сахарозу aCSF. Приколите все четыре угла препарата (вентральной поверхностью вверх), поместив булавки через мышцы нижней части спины и прикрепленные верхние ребра.
6. Удалите всю мышечную и соединительную ткань, лежащую над вентральной поверхностью позвонков с помощью ронжеров, и определите область позвонка над пояснично-крестцовым расширением, которое находится примерно под телами позвонков от T12 до L2.
7. Удалите тело позвонка, которое находится каудально по отношению к пояснично-крестцовой области, чтобы обеспечить доступ к спинному мозгу, поскольку он находится в позвоночном канале.
8. С помощью изогнутых пружинных ножниц разрежьте ножки позвонков с двух сторон, поднимая и вытягивая тело позвонка рострально, чтобы разделить вентральную и дорсальную части позвонков и обнажить спинной мозг.
9. После того, как тела позвонков будут удалены, чтобы выявить пояснично-крестцовое увеличение, осторожно очистите оставшиеся корни, которые фиксируют спинной мозг, пружинными ножницами, пока спинной мозг не освободится.
10. Изолируйте спинной мозг ростральными и каудальными разрезами значительно выше и ниже пояснично-крестцового расширения, позволяя целевой области спинного мозга «свободно плавать><». заметка: Предпочтительная ориентация среза определит, как шнур будет впоследствии закреплен для секционирования (Рисунок 1).
11. Для поперечных срезов приподнимите пояснично-крестцовый сегмент за прикрепленный корень и поместите его на предварительно вырезанный блок полистирола (пенополистирола) (1 см x 1 см x 1 см) с неглубоким каналом, вырезанным в центре. С помощью цианоакрилатного клея (см. Таблицу материалов) прикрепите блок и шнур к режущей платформе и поместите его в ванну для резки, содержащую ледяную сахарозу aCSF (суспензию).
    заметка: Неглубокий канал помогает закрепить и сориентировать спинной мозг, при этом дорсальная сторона обнажена, а грудной конец спинного мозга находится в нижней части блока.
12. Для сагиттальных срезов уложите тонкую линию цианоакрилатного клея на платформу для раздела, приподнимите пояснично-крестцовое расширение за прикрепленный корень и поместите шнур вдоль линии клея, убедившись, что одна боковая поверхность находится в клее, а другая обращена вверх. Поместите его в ванну для резки, содержащую ледяную сахарозу aCSF (кашицу).
13. Для горизонтальных срезов нанесите тонкую линию цианоакрилатного клея на платформу для разделки. Приподнимите пояснично-крестцовое расширение за прикрепленный корень и поместите пояснично-крестцовое расширение вдоль линии клея, убедившись, что вентральная поверхность находится в клее, а тыльная поверхность обращена вверх. Используйте прикрепленные корни для позиционирования шнура. Поместите его в ванну для резки, содержащую ледяную сахарозу aCSF (кашицу).

5. Запись микроэлектродной матрицы

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги подробно описывают, как использовать данные записи из экспериментов на основе MEA на срезах спинного мозга. В зависимости от эксперимента можно использовать несколько конструкций MEA. Детали конструкции МПС, использованных в этих экспериментах, показаны в таблице 2 и на рисунке 2. Подробная информация о проектировании была опубликована Egert et al. и Thiebaud et al. для плоских и трехмерных (3D) MEA соответственно. Оба типа MEA состоят из 60 электродов из нитрида титана с изоляционным слоем из нитрида кремния, а также дорожек и контактных площадок из нитрида титана.

1. Экспериментальная установка
   1. Включите компьютер и интерфейсную плату, а затем запустите программное обеспечение для записи.
   2. Загрузите предварительно собранный шаблон записи (рисунок 3A). Назовите файлы за день во вкладке регистратора.
   3. Непрерывно пузырите аCSF карбогеном (5%_CO2, 95%_O2) в течение всего эксперимента.
   4. Включите систему перфузии, которая управляется перистальтическим насосом. Поместите впускной трубопровод в аCSF, а впускной конец в стакан для отходов. Загрунтуйте перфузионные линии с помощью кислотно-кислотного фильтра.
   5. Готовят 4-АД и любые другие лекарственные растворы путем разведения запасов в 50 мл аКСФ до необходимой конечной концентрации (например, 200 мкМ для 4-АД).
2. Активность 4-аминопиридина (4-АР)
   1. После инкубации перенесите один срез из инкубатора с помощью пастеровской пипетки Пастера с большим наконечником, наполненной aCSF.
   2. Поместите ломтик в лунку MEA и добавьте дополнительный aCSF.
   3. Расположите срез над 60-электродной записывающей матрицей с помощью тонкой кисти с коротким ворсом. Избегайте контакта электродов с кистью или перетаскивания ткани по электродам, особенно при использовании 3D-матриц.
      заметка: В зависимости от компоновки MEA это может быть сделано с помощью микроскопа или без него для точного позиционирования.
   4. После позиционирования среза наложите на ткань утяжеленную сетку, чтобы удерживать ее на месте и обеспечить хороший контакт с электродами MEA.
      заметка: После размещения сетки срез может потребовать изменения положения.
   5. Поместите MEA в записывающую головку (рис. 2A, B).
   6. Проверьте положение ткани над электродами с помощью инвертированного микроскопа (2-кратное увеличение), чтобы убедиться, что как можно больше электродов находится под поверхностным тыльным рогом (SDH). Убедитесь, что по крайней мере 2-6 электродов не соприкасаются со срезом, так как эти электроды важны для вычитания шума и записи артефактов во время анализа (Рисунок 2E).
   7. Включите камеру, подключите ее к устройству и сделайте эталонное изображение среза относительно MEA для использования во время анализа.
   8. Нажмите «Запустить сбор данных» в программном обеспечении для записи и убедитесь, что все электроды получают четкий сигнал.
      заметка: Если сигнал зашумлен, отсоедините верхнюю часть и очистите контактные площадки MEA и контакты с золотыми пружинами 70% этанолом (используйте лабораторную салфетку, чтобы убедиться, что контактные площадки и контакты сухие после очистки). Если сигнал по-прежнему зашумлен, отключите неисправные электроды в программном обеспечении для записи или запишите для исключения позже во время анализа.
   9. Подсоедините входной и выходной трубопроводы перфузии к лунке MEA (предварительно заполненной антикоксовой) и включите систему перфузии. Проверьте скорость потока, в идеале 4-6 объемов ванны в минуту, и убедитесь, что отток достаточен для предотвращения переполнения суперфузата.
   10. Дайте ткани сбалансироваться в течение 5 минут, а затем запишите 5 минут необработанных, неотфильтрованных исходных данных.
   11. Переместите входную линию перфузии из аКСФ в раствор 4-АП и подождите 12 минут, пока ритмическая активность, индуцированная 4-АП, достигнет устойчивого состояния (2 минуты для того, чтобы лекарства достигли ванны, и 10 минут, чтобы активность достигла пика и затем стабилизировалась).
   12. Запишите 5 минут 4-АП-индуцированной активности. Будьте готовы к последующим записям, чтобы протестировать препараты или проверить стабильность 4-АП.

Таблица 1: Составы искусственной спинномозговой жидкости.

Таблица 2: Схемы микроэлектродных матриц.

Рисунок 1: Ориентация срезов спинного мозга, методы крепления и разрезания. (A) Для поперечных срезов требуется отрезной блок из пенополистирола с вырезанным в нем поддерживающим пазом. Спинной мозг упирается в блок в опорной канавке, тыльная сторона спинного мозга обращена в сторону от блока. Блок и шнур приклеиваются к режущему столику с помощью цианоакрилатного клея. (В) Сагиттальные срезы получают путем нанесения тонкой линии цианоакрилатного клея на этап резки, а затем располагают спинной мозг на боку на клее. (C) Горизонтальные срезы готовятся путем нанесения тонкой линии цианоакрилатного клея на режущую ступень, а затем располагаются вентральной стороной спинного мозга вниз на клее.

Рисунок 2: Позиционирование тканей на микроэлектродной решетке. (A) На изображении показана открытая сцена MEA с установленной MEA. (В) То же, что и А, с закрытой для записи и установленной системой перфузии тканей. (C) На изображении показана MEA в том виде, в котором она предоставлена производителем. Показаны контактные подушечки, которые соприкасаются с золотыми пружинами сцены, и тканевая ванна MEA, в которой находится тканевый раствор для купания и срез ткани. Область, выделенная красным квадратом в центре, является местом расположения электродной матрицы. (D) На схемах показаны две конфигурации электродов MEA, использованные в этом исследовании, более подробная информация представлена в таблице 2. Электрод сравнения обозначен синей трапецией. На левом раскладе электродов MEA показана квадратная конфигурация с 60 электродами, наиболее часто используемая в представленных рабочих моделях 60MEA200/30iR-Ti с электродами диаметром 30 мкм, расположенными на расстоянии 200 мкм друг от друга, или 200 мкм с интервалом 200 мкм и 100 мкм на расстоянии 3-мерных МЭА (60MEA200/12/50iR-Ti и 60MEA100/12/40iR-Ti) с электродами диаметром 12 мкм и высотой 50 мкм или 40 мкм, соответственно. На левом раскладе электродов MEA показана прямоугольная раскладка электродов 6 x 10 - 60MEA500/30iR-Ti. (E) Изображение с большим увеличением квадратного MEA 60MEA100/12/40iR-Ti квадратного MEA с поперечным срезом спинного мозга, расположенным для записи. Срез сидит на рядах электродов 3-8. Верхний ряд электродов, которые не соприкасаются с какими-либо тканями, служат электродами сравнения. Область SDH отображается в виде полупрозрачной полосы. В этом случае SDH перекрывает электроды в рядах 4, 5 и 6 и столбцах 2, 3, 4, 5 и 7 MEA. Масштабная линейка = 200 мкм. Сокращения: MEA = микроэлектродная решетка; SDH = поверхностный спинной рог.

Рисунок 3: Схемы инструментов записи и анализа данных и примеры записей микроэлектродных матриц, показывающих потенциал внеклеточного действия и формы волн потенциала локального поля. (A) На схеме показан предварительно настроенный шаблон записи, используемый для сбора данных MEA. Связывание MEA2100 и инструмента записи (головного сцены/усилителя) позволяет называть данные и сохранять их. Четыре примера трассировки исходных данных (справа, 5-минутные эпохи) были собраны одним каналом MEA, показывающим активность на исходном уровне, через 12 минут после применения 4-AP, еще через 15 минут после установленной активности 4-AP и после применения TTX в ванне (1 μM). Обратите внимание, что добавление 4-AP (второй след) приводит к явному увеличению фонового шума и активности EAP/LFP. Важно отметить, что активность остается относительно стабильной в течение как минимум 15 мин после установления 4-AP-индуцированной активности (третий след). Добавление TTX (1 мкМ) отменяет всякую активность (донную кривую). (B) На схеме (слева) показана конфигурация программного обеспечения анализатора для анализа данных. Обозреватель необработанных данных используется для импорта записей, собранных программным обеспечением для записи данных. Затем эти данные пропускаются через инструмент фильтрации с перекрестными каналами, который вычитает выбранный сигнал (сигналы) электродов сравнения из других электродов для удаления фонового шума. Данные проходят через фильтр EAP и фильтр LFP для оптимизации соотношения сигнал/шум для каждой формы сигнала. После этого данные о пути EAP поступают в инструмент детектора EAP, где устанавливаются пороговые значения. EAP обнаруживаются и затем отправляются в средство анализа EAP, где задержки каждого события записываются и экспортируются в виде txt. файл. Идентичный рабочий процесс выполняется для данных LFP с использованием соответствующего инструментария LFP. Правые кривые показывают данные из одного канала MEA, содержащего различные внеклеточные волны. Расположение сигналов EAP и LFP выделено на приведенных выше «растрах подсчета». Нижние трассы — это эпохи от верхней записи (обозначены красными полосами), показывающие формы волн на расширенной временной шкале, включая различные сигналы LFP (обратите внимание на разнообразие появлений) и отдельные внеклеточные EAP (красные круги). Обратите внимание, что форма и полярность сигнала LFP/EAP изменяются в зависимости от количества нейронов, производящих эти сигналы, их близости к записывающему электроду и их расположения по отношению к ближайшему электроду (электродам). Сокращения: MEA = микроэлектродная решетка; EAP = потенциал внеклеточного действия; LFP = потенциал локального поля; 4-АР = 4-аминопиридин; ТТХ = тетродотоксин.