$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Электрофизиология in vitro
- Приготовление растворов для подготовки и записи срезов спинного мозга
- Искусственная спинномозговая жидкость
заметка: Искусственная спинномозговая жидкость (КСФ) используется в интерфейсной инкубационной камере, где срезы хранятся до начала записи и во время экспериментов в качестве перфузата и разбавителя для лекарственных препаратов. Подробный состав см. в таблице 1.
- Приготовьте aCSF, содержащую (в мМ) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 глюкозу, 2,5 KCl, 12PO4, 1 MgCl2 и 2,5 CaCl2, добавив необходимые количества вышеуказанного, исключая CaCl2, в 2 л дистиллированной воды.
- Пузырите вышеуказанный раствор карбогеном (95% O2, 5% CO2) в течение 5 минут и добавьте CaCl2,< бр />
заметка: Этот шаг предотвращает выпадение CaCl2, т. е. раствор не должен мутнеть. Для применения препарата во время экспериментов разбавляйте исходные растворы препарата в аКСФ до желаемых конечных концентраций.
2. Искусственная спинномозговая жидкость, замещенная сахарозой
ПРИМЕЧАНИЕ: Сахарозазамещенный aCSF используется во время рассечения и разрезания спинного мозга. Как следует из названия, сахароза является заменителем NaCl для снижения возбуждения нейронов во время этих процедур при сохранении осмолярности. Подробный состав см. в таблице 1.
- Приготовьте сахарозозамещенную aCSF, содержащую (в мМ) 250 сахарозы, 25 NaHCO3, 10 глюкозу, 2,5 KCl, 12PO4, 1 MgCl2 и 2,5 CaCl2, добавив необходимые количества всех вышеперечисленных веществ, исключая CaCl2, в 300 мл дистиллированной воды.
- Пузырите раствор с карбогеном в течение 5 минут, а затем добавьте CaCl2.
- Храните раствор в морозильной камере при температуре -80 °C в течение примерно 40 минут или до тех пор, пока раствор не образует кашицу. Избегайте замерзания и используйте в консистенции кашицы.
3. Подготовка микроэлектродной матрицы
ПРИМЕЧАНИЕ: Контактная поверхность MEA требует предварительной обработки, чтобы сделать ее гидрофильной.
- Перед экспериментом хорошо заполните MEA либо фетальной бычьей сывороткой (FBS), либо лошадиной сывороткой (HS) в течение 30 минут.
- Удалите FBS или HS и тщательно промойте MEA примерно пятью промывками дистиллированной воды, пока дистиллированная вода не перестанет пениться. Заполните лунку кислотномозговой жидкостью, готовой к использованию.
4. Подготовка острого разреза спинного мозга
- Глубоко обезболите мышь 100 мг/кг кетамина (внутримышечно), а затем обезглавьте ее с помощью больших хирургических ножниц.
- Снимите кожу над областью живота, сделав небольшой надрез на коже на уровне бедер. Натягивайте кожу по обе стороны разреза рострально до тех пор, пока не будет удалена вся кожа, т. е. от верхней части грудной клетки до верхней части таза (как вентрально, так и дорсально).
- Положите тело на лед и используйте вентральный доступ, чтобы обнажить позвоночный столб, удалив все внутренности и разрезав ребра латерально к грудине
.
- Удалите брюшную грудную клетку, обе лопатки (отрезанные примерно в Т2), а также нижние конечности и таз (отрезанные примерно в верхней части крестца).
- Перенесите подготовку позвоночного столба и ребер в рассекающую ванну, содержащую ледяную сахарозу aCSF. Приколите все четыре угла препарата (вентральной поверхностью вверх), поместив булавки через мышцы нижней части спины и прикрепленные верхние ребра.
- Удалите всю мышечную и соединительную ткань, лежащую над вентральной поверхностью позвонков с помощью ронжеров, и определите область позвонка над пояснично-крестцовым расширением, которое находится примерно под телами позвонков от T12 до L2.
- Удалите тело позвонка, которое находится каудально по отношению к пояснично-крестцовой области, чтобы обеспечить доступ к спинному мозгу, поскольку он находится в позвоночном канале.
- С помощью изогнутых пружинных ножниц разрежьте ножки позвонков с двух сторон, поднимая и вытягивая тело позвонка рострально, чтобы разделить вентральную и дорсальную части позвонков и обнажить спинной мозг.
- После того, как тела позвонков будут удалены, чтобы выявить пояснично-крестцовое увеличение, осторожно очистите оставшиеся корни, которые фиксируют спинной мозг, пружинными ножницами, пока спинной мозг не освободится.
- Изолируйте спинной мозг ростральными и каудальными разрезами значительно выше и ниже пояснично-крестцового расширения, позволяя целевой области спинного мозга «свободно плавать><».
заметка: Предпочтительная ориентация среза определит, как шнур будет впоследствии закреплен для секционирования (Рисунок 1).
- Для поперечных срезов приподнимите пояснично-крестцовый сегмент за прикрепленный корень и поместите его на предварительно вырезанный блок полистирола (пенополистирола) (1 см x 1 см x 1 см) с неглубоким каналом, вырезанным в центре. С помощью цианоакрилатного клея (см. Таблицу материалов) прикрепите блок и шнур к режущей платформе и поместите его в ванну для резки, содержащую ледяную сахарозу aCSF (суспензию).
заметка: Неглубокий канал помогает закрепить и сориентировать спинной мозг, при этом дорсальная сторона обнажена, а грудной конец спинного мозга находится в нижней части блока.
- Для сагиттальных срезов уложите тонкую линию цианоакрилатного клея на платформу для раздела, приподнимите пояснично-крестцовое расширение за прикрепленный корень и поместите шнур вдоль линии клея, убедившись, что одна боковая поверхность находится в клее, а другая обращена вверх. Поместите его в ванну для резки, содержащую ледяную сахарозу aCSF (кашицу).
- Для горизонтальных срезов нанесите тонкую линию цианоакрилатного клея на платформу для разделки. Приподнимите пояснично-крестцовое расширение за прикрепленный корень и поместите пояснично-крестцовое расширение вдоль линии клея, убедившись, что вентральная поверхность находится в клее, а тыльная поверхность обращена вверх. Используйте прикрепленные корни для позиционирования шнура. Поместите его в ванну для резки, содержащую ледяную сахарозу aCSF (кашицу).
5. Запись микроэлектродной матрицы
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги подробно описывают, как использовать данные записи из экспериментов на основе MEA на срезах спинного мозга. В зависимости от эксперимента можно использовать несколько конструкций MEA. Детали конструкции МПС, использованных в этих экспериментах, показаны в таблице 2 и на рисунке 2. Подробная информация о проектировании была опубликована Egert et al. и Thiebaud et al. для плоских и трехмерных (3D) MEA соответственно. Оба типа MEA состоят из 60 электродов из нитрида титана с изоляционным слоем из нитрида кремния, а также дорожек и контактных площадок из нитрида титана.
- Экспериментальная установка
- Включите компьютер и интерфейсную плату, а затем запустите программное обеспечение для записи.
- Загрузите предварительно собранный шаблон записи (рисунок 3A). Назовите файлы за день во вкладке регистратора.
- Непрерывно пузырите аCSF карбогеном (5%CO2, 95%O2) в течение всего эксперимента.
- Включите систему перфузии, которая управляется перистальтическим насосом. Поместите впускной трубопровод в аCSF, а впускной конец в стакан для отходов. Загрунтуйте перфузионные линии с помощью кислотно-кислотного фильтра.
- Готовят 4-АД и любые другие лекарственные растворы путем разведения запасов в 50 мл аКСФ до необходимой конечной концентрации (например, 200 мкМ для 4-АД).
- Активность 4-аминопиридина (4-АР)
- После инкубации перенесите один срез из инкубатора с помощью пастеровской пипетки Пастера с большим наконечником, наполненной aCSF.
- Поместите ломтик в лунку MEA и добавьте дополнительный aCSF.
- Расположите срез над 60-электродной записывающей матрицей с помощью тонкой кисти с коротким ворсом. Избегайте контакта электродов с кистью или перетаскивания ткани по электродам, особенно при использовании 3D-матриц.
заметка: В зависимости от компоновки MEA это может быть сделано с помощью микроскопа или без него для точного позиционирования.
- После позиционирования среза наложите на ткань утяжеленную сетку, чтобы удерживать ее на месте и обеспечить хороший контакт с электродами MEA.
заметка: После размещения сетки срез может потребовать изменения положения.
- Поместите MEA в записывающую головку (рис. 2A, B).
- Проверьте положение ткани над электродами с помощью инвертированного микроскопа (2-кратное увеличение), чтобы убедиться, что как можно больше электродов находится под поверхностным тыльным рогом (SDH). Убедитесь, что по крайней мере 2-6 электродов не соприкасаются со срезом, так как эти электроды важны для вычитания шума и записи артефактов во время анализа (Рисунок 2E).
- Включите камеру, подключите ее к устройству и сделайте эталонное изображение среза относительно MEA для использования во время анализа.
- Нажмите «Запустить сбор данных» в программном обеспечении для записи и убедитесь, что все электроды получают четкий сигнал.
заметка: Если сигнал зашумлен, отсоедините верхнюю часть и очистите контактные площадки MEA и контакты с золотыми пружинами 70% этанолом (используйте лабораторную салфетку, чтобы убедиться, что контактные площадки и контакты сухие после очистки). Если сигнал по-прежнему зашумлен, отключите неисправные электроды в программном обеспечении для записи или запишите для исключения позже во время анализа.
- Подсоедините входной и выходной трубопроводы перфузии к лунке MEA (предварительно заполненной антикоксовой) и включите систему перфузии. Проверьте скорость потока, в идеале 4-6 объемов ванны в минуту, и убедитесь, что отток достаточен для предотвращения переполнения суперфузата.
- Дайте ткани сбалансироваться в течение 5 минут, а затем запишите 5 минут необработанных, неотфильтрованных исходных данных.
- Переместите входную линию перфузии из аКСФ в раствор 4-АП и подождите 12 минут, пока ритмическая активность, индуцированная 4-АП, достигнет устойчивого состояния (2 минуты для того, чтобы лекарства достигли ванны, и 10 минут, чтобы активность достигла пика и затем стабилизировалась).
- Запишите 5 минут 4-АП-индуцированной активности. Будьте готовы к последующим записям, чтобы протестировать препараты или проверить стабильность 4-АП.
Таблица 1: Составы искусственной спинномозговой жидкости.
См.
| химический | аКСФ (мМ) | КСФ (г/100 мл) | Сахарозазамещенная аКСФ (мМ) | Заменившая сахарозу аКСФ (г/100 мл) | Высокое содержание кислотно-мозгового белка калия (мМ) | Кислотномозговая жидкость с высоким содержанием калия (г/100 мл) |
| Хлорид натрия (NaCl) | 118 | 0.690 | - T | - T | 118 | 0.690 |
| Гидрокарбонат натрия (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| глюкоза | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
| Хлорид потазия (KCl) | 2.5 | 0,019 | 2.5 | 0,019 | 4.5 | 0,034 |
| Натрия дигидрофосфат (2PO4) | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 |
| Хлорид магния (MgCl2) | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 |
| Хлорид кальция (CaCl2) | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 |
| сахароза | - T | - T | 250 | 8.558 | - T | - T |
Таблица 2: Схемы микроэлектродных матриц.
| Схемы микроэлектродных матриц |
| Модель микроэлектродной матрицы | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Плоский или 3-мерный (3D) | плоскостной | 3D | 3D | плоскостной |
| Электродная сетка | 8 х 8 | 8 х 8 | 8 х 8 | 6 х 10 |
| Расстояние между электродами | 200 мкм | 100 мкм | 200 мкм | 500 мкм |
| Диаметр электрода | 30 μм | 12 мкм | 12 мкм | 30 μм |
| Высота электрода (3D) | Н/Д | 40 μм | 50 мкм | Н/Д |
| Эксперименты | Поперечный срез | Поперечный срез | Сагиттальный + Горизонтальный | Сагиттальный + Горизонтальный |
