Регистрация изменений активности почечных симпатических нервов в ответ на артериальное давление у крыс

Аннотация

Источник: Fink, A. M., et al. количественная оценка острых изменений активности симпатического нерва почек в ответ на манипуляции с центральной нервной системой у крыс под наркозом. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует технику изучения активности почечных симпатических нервов (RSN) в ответ на изменения артериального давления у крыс. При прикреплении чувствительного к давлению катетера к бедренной артерии почечные симпатические нервы обнажаются. Затем нервы поднимаются на регистрирующий электрод, и их электрическая активность записывается. Затем вводится сосудосуживающий препарат для повышения артериального давления, и контролируются соответствующие изменения активности RSN.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Создание биполярных электродов RSNA

1. Чтобы создать электрод, отрежьте два куска проволоки из нержавеющей стали длиной примерно 18 мм каждый. Отрежьте один кусок полиэтиленовой (ПЭ-50) трубки длиной примерно 15 мм. Вставьте оба куска проволоки в трубку, оставив проволоку торчащей с обоих концов.
2. Снимите изоляцию с концов проводов, обрежьте провода, оставив 2-3 мм оголенного провода. С одного конца обжмите штыри с наружной резьбой над оголенным проводом. Надежно припаяйте контакты к проводу, закрепите контакты внутри соединительной планки и закройте соединение эпоксидной смолой.
   заметка: Альтернативный подход, который позволяет избежать пайки, заключается в использовании быстроразъемных зажимов типа «крокодил».
3. На противоположном конце электрода снимите изоляцию с концов проводов, оставив 2-3 мм оголенного провода. Согните эту часть проводов, чтобы в неизолированном проводе получились маленькие крючки в форме буквы «V».
   заметка: Это часть электрода, которая будет контактировать с почечным симпатическим нервом. Важно герметизировать этот конец, чтобы предотвратить попадание жидкостей внутрь трубки. Эффективно можно использовать силикон или эпоксидную смолу.

2. Введение анестезии и подготовка хирургических участков

1. Ввести анестезию самцу крысы Sprague Dawley (возраст 9-11 недель, вес 150-400 г). Введите пентобарбитал натрия в дозе 50 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции (ВП). Чтобы оценить стабильную плоскость анестезии во время операции, проверяйте рефлекс пальцев ног каждые 15 минут и при необходимости повторно дозируйте анестезию.
   заметка: Пентобарбитал натрия (нембутал) использовался в предыдущих исследованиях для достижения устойчивой плоскости анестезии без вмешательства в модуляцию RSNA. Этот протокол предназначен для хирургии без выживания, поэтому период восстановления/послеоперационного мониторинга отсутствует.
2. Подготовьте место операции в соответствии с рекомендациями по уходу за животными (т.е. побрейте живот, спину и голову крысы; очистите кожу 10% раствором повидон-йода; нанесите смазку для глаз и положите крысу на грелку). Во время экспериментов поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C.

3. Канюлирование бедренной артерии для мониторинга среднего артериального давления

1. Визуализируйте артерию под микроскопом. Аналогично методу, используемому для канюляции вен, перевяжите дистальный шов, чтобы окклюзировать артерию; Закрепите края этого шва на операционном поле шелковой лентой и расположите артерию перпендикулярно доминирующей руке хирурга.
2. Артериальный доступ при использовании телеметрии
   1. Перед канюляцией артерии осмотрите чувствительный к давлению катетер под большим увеличением. Убедитесь, что катетер свободен от пузырьков/мусора и имеет неповрежденный мениск между заполненными жидкостью (проксимальными) и геленаполненными (дистальными) компонентами. Перед каждой имплантацией заправляйте гель на дистальном кончике катетера. Включите передатчик с помощью магнита; контролировать артериальное давление (АД) во время операции, чтобы выдержать идеальную установку.
   2. Используйте свободный верхний полуузел в проксимальном отделе шва, чтобы кратковременно окклюзировать бедренную артерию. Держите интродьюсер катетера в недоминантной руке. Удерживайте наконечник канюли телеметрического блока щипцами для канюляции сосудов, чтобы избежать вытеснения геля с наконечника.
   3. Проколите отверстие в артерии изогнутой иглой 22G и введите канюлю в артерию с помощью щипцов для канюляции сосудов, чтобы избежать вытеснения геля с наконечника. Продвинуте канюлю как можно дальше. С помощью проксимальных и дистальных шовных связей закрепите давящий катетер.
   4. Подверните тело телеметрического имплантата внутрь бока, прилегающего к разрезу, и закройте этот разрез с помощью нейлонового шва 4-0 на режущей игле. Выключите телеметрические устройства с помощью магнита по окончании периода записи, чтобы продлить срок службы батареи.

4. Расположите крысу в рамке стереотаксической хирургии, чтобы получить доступ к мозгу

1. Осторожно переместите крысу в положение лежа в стереотаксической операционной раме.
2. Расположите крысу между ушными планками и отрегулируйте планку резцов, чтобы выровнять высоту лямбды и брегмы. Расположение может зависеть от напряжения крысы, веса и расположения мишеней центральной нервной системы (ЦНС).
3. Сделайте рострокаудальный скальпель на расстоянии 2 см через среднюю линию волосистой части головы. С помощью аппликаторов с ватным наконечником плотно удалите соединительную ткань с поверхности черепа. Нанесите перекись водорода на череп, чтобы помочь в визуализации брегма, лямбда и срединных швов.
4. Используя атлас мозга крысы для наведения, просверлите остеотомическое отверстие в виде заусенца, размер которого позволяет получить доступ к электроду, через череп.

5. Изоляция почечных симпатических нервов

1. Подключите проводной электрод RSNA (шаги 1.1-1.3) к усилителю предварительной подготовки 10X и усилителю микроэлектрода.
2. Изолируйте почечные нервы через забрюшинный разрез до или после того, как крыса будет закреплена в стереотаксической раме. Расположите электроды RSNA, когда крыса окажется в стереотаксической раме. Сделайте скальпельный надрез, простирающийся от 4-5 см ниже ребер в каудальном направлении, немного сбоку от позвоночника. Блант рассекает разрез, чтобы визуализировать параспинальные мышцы.
3. С помощью ножниц сделайте очень поверхностный 1-2 см рострокаудальный разрез, где жир встречается с мышцей. С помощью аппликаторов с ватным наконечником распределите жир от мышцы, чтобы визуализировать почку. Важно не попадать в брюшинное пространство.
4. Используйте ретракторы, чтобы аккуратно отделить почку от параспинальных мышц, чтобы визуализировать почечную артерию и брюшную аорту. Не растягивайте сосуды чрезмерно, чтобы не повредить почечные нервы. Используйте ватный марлевый диск размером 2 x 2 дюйма, смоченный в физрастворе, чтобы защитить почку от травм.
5. При большом увеличении определите почечные нервы в кармане разреза. Нервные пучки наиболее хорошо видны в прямом углу, образованном аортой и почечной артерией. Почечные нервы тесно следуют за почечной артерией от аорты к почкам.
6. Выберите сегмент нервного пучка, который будет размещен на записывающем электроде. Аккуратно рассеките нервные волокна из окружающих тканей/сосудов с помощью микрорассекающего пинцета.
7. Закрепите проволочный электрод RSNA в держателе (например, в зажиме типа «крокодил», прикрепленном к опорной подставке). Опустите электрод до уровня нервного сегмента. Используйте нервный крючок, чтобы аккуратно поднять сегмент почечного нерва на электрод, не растягивая нерв.
   заметка: Нерв должен находиться внутри обоих V-образных крючков в неизолированном проводе, параллельно нерву. Электродные провода не должны соприкасаться с какими-либо другими тканями, кровью или лимфатической жидкостью.
8. Заполните разрез минеральным маслом, чтобы предотвратить сухость оголенного почечного симпатического нерва. Используйте заземляющий зажим так, чтобы один конец находился на коже разреза, а другой был прикреплен к клетке Фарадея.
9. Направляйте сигнал на усилители с помощью фильтрации высоких и низких частот (10 Гц и 3 кГц). Отрегулируйте коэффициент усиления до 10 K. Включите аудиомонитор для оценки диаграммы направленности RSNA. Используйте частоту дискретизации в диапазоне от 2 000 до 10 000 Гц. Используйте повышенную частоту дискретизации, когда предполагается, что манипуляция с ЦНС вызовет быстрые/кратковременные симпатические реакции.

6. Данные записи

1. Оцените качество записи РСНК путем вызова барорефлекса с помощью болюсной инъекции 1 мл физиологического раствора или 10 мкг/мл фенилэфрина (в 0,1 мл) внутривенно. Как показано на рисунке 1, инфузия должна повышать АД и ингибировать РНК. Повышение среднего артериального давления на 60-80 мм рт.ст. достаточно для почечного симпатоингибирования.
2. При необходимости отрегулируйте положение электродов для улучшения сигнала. Изменение положения требуется, если нерв не соприкасается с обоими крючками на электроде или если какие-либо ткани, кровь или лимфатическая жидкость контактируют с проводами.
   заметка: Необходимость изменения положения основывается на слуховых характеристиках нервных разрядов.
3. Как только будет получен четкий сигнал, закрепите электрод RSNA на месте, удалив минеральное масло и нанеся силикагель, чтобы покрыть соединение нерв/электрод в кармане разреза. Не перемещайте крысу до тех пор, пока гель полностью не схватится.
4. Выполняйте протоколы манипуляций с ЦНС с непрерывной регистрацией РСНА и среднего артериального давления. Если для манипуляций со стволом мозга используется микроинъектор/пульсатор, логический сигнал от этого устройства может быть введен в записи RSNA/BP для документирования времени манипуляций с ЦНС.
5. Когда эксперимент будет завершен, определите уровень шума, сдавливая нерв проксимальнее записывающих электродов между силикагелем и спинномозговой мышцей. Запишите не менее 30 с этого «нулевого» значения для RSNA. В качестве альтернативного подхода к количественной оценке шума введите ганглиарный блокатор короткого действия, такой как атропин, гексаметоний, хлоризондамин или тартрат пентолиния.
6. Осторожно снимите электрод RSNA и удалите все следы силикагеля с проволочных электродов. Сохраните электрод для повторного использования. Выключите телеметрический передатчик и извлеките его, стараясь не повредить кончик катетера.

Результаты

Рисунок 1: РСНК и АД в ответ на внутривенное введение фенилэфрина.Необработанную РССЯ (А) проводили полноволновой ректификацией (В); ректифицированный измельченный «ноль» РСНК показан на врезке С. Рассчитаны неперекрывающиеся средние значения за 10 с (за вычетом шума) (D). Чтобы вызвать барорефлекс, внутривенно вводили 0,1 мл фенилэф...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Проволока из нержавеющей стали	A-M Systems; Секим, Вашингтон	791000	Электрод RSNA
Полиэтиленовые (ПЭ-50) трубки	VWR; Раднор, Пенсильвания	63019-048	RSNA-электрод; канюляция сосудов
Миниатюрный штыревой разъем	A-M Systems; Секим, Вашингтон	520200	Электрод RSNA
Инструмент для обжима	Daniels Manufacturing Corp.; Орландо, Флорида	М22520	Электрод RSNA
Соединительная планка	Амфенол; Клинтон Тауншип, Мичиган	221-2653	Электрод RSNA
Эпоксидная смола J-B Kwik	J-B Weld, Серные пружины, Техас	8270	Электрод RSNA
силикон	Перматекс; Хартфорд, Коннектикут	2222	Электрод RSNA
Гепарин натрия; Инъекционный (флакон 10 мл, 1000 Ед/мл)	KV Veterinary Supply; Дэвид Сити, Небраска	П03466	Проходимость венозной линии
Фенилэфрин гидрохлорид; Инъекционный (флакон 1 мл; 10 мг/мл)	Хирургические поставки ACE; Броктон, Массачусетс	950-6312	Тестирование почечного симпатоингибирования
Эластичные хирургические крепления с одним крючком	Гарвардский аппарат; Холлистон, Массачусетс	72-2595	надрез
Шелковая хирургическая лента	3M, Миннеаполис, Миннесота	1538-0	Безопасное хирургическое пребывание
Иглы, 20 г	Сигма-Олдрич; Сент-Луис, Миссури	Z192554-100 шт.	Канюляция сосудов
Изогнутые щипцы Dumont #7	Инструменты тонкой науки; Фостер-Сити, Калифорния	11274-20	Канюляция сосудов
5-0 Шелковые шовные завязки	Braintree Scientific; Брейнтри, Массачусетс	СУТ-С 106	Канюляция сосудов
Нежные кровоостанавливающие щипцы	Робоз Хирургический Инструмент Ко.; Гейтерсберг, Мэриленд	РС-7117	Канюляция сосудов и хирургия РНК
Кровоостанавливающие щипцы Crile	Инструменты тонкой науки; Фостер-Сити, Калифорния	13004-14	Гибка иглой
Передатчик телеметрии	Data Sciences International; Миннеаполис, Миннесота	ПА-10	Мониторинг среднего артериального давления (телеметрия)
Регелевый шприц	Data Sciences International; Миннеаполис, Миннесота	276-0038-001	Повторное использование передатчика (телеметрия)
Одноразовый преобразователь давления	Транспак; Сан-Клементе, Калифорния	МИ-1224	Мониторинг среднего артериального давления
Заварочный узел под давлением с прозрачной манжетой	MILA International Inc.; Флоренция, Кентукки	2281339	Мониторинг среднего артериального давления
Щипцы для канюляции сосудов	Инструменты тонкой науки; Фостер-Сити, Калифорния	00574-11	Введение катетера
Черная мононить нейлоновая 4-0 шовная нить на игле обратной резки	Медико-хирургический центр Маккессона; Сан-Франциско, Калифорния	С661GX	Защищенный телеметрический передатчик
Приемник телеметрии	Data Sciences International; Миннеаполис, Миннесота	РПК-1	Мониторинг среднего артериального давления (телеметрия)
LabChart Pro (программное обеспечение), PowerLab (оборудование для сбора данных)	AD Instruments; Колорадо-Спрингс, Колорадо	ML846, матрица MX2 2.0 (совместима с телеметрией Data Science International)	3 варианта программного обеспечения/оборудования для сбора данных
SciWorks (программное обеспечение), DataWave (оборудование для сбора данных)	DataWave Technologies, Лавленд, Колорадо	Н/Д
Spike 2 (программное обеспечение), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., Лондон, Великобритания	1401-3
Микродрель	Робоз Хирургический Инструмент Ко.; Гейтерсберг, Мэриленд	РС-6300	Хирургия ЦНС
Стереотаксическая операционная рама	Ходьба; Вуд Дейл, Иллинойс	51600	Хирургия ЦНС
Микроэлектродный усилитель с 10-кратным предусилителем	A-M Systems; Секим, Вашингтон	1800-2	Запись RSNA
Втягивающие устройства	Инструменты тонкой науки; Фостер-Сити, Калифорния	17009-07	Запись RSNA
Микрорассекающий пинцет	Инструменты тонкой науки; Фостер-Сити, Калифорния	11251-10	Запись RSNA
Микрокрючок	Инструменты тонкой науки; Фостер-Сити, Калифорния	10064-14	Запись RSNA
нефтепродукт	Fisher Scientific; Уолтем, Массачусетс	8042-47-5	Запись RSNA
Аудиомонитор	A-M Systems; Секим, Вашингтон	No 3300	Запись RSNA
Силикагель	Wacker, München; Германия	РТ601А-Б	Запись RSNA
Электрические зажимы	Tyco Electronics; Шаффхаузен, Швейцария	ЕВ0283-000	Заземление или закрепление перфузионной иглы
Боннские ножницы, прямые/острые концы	Roboz Surgical Instrument Co; Гейтерсберг, Мэриленд	РС-5840	перфузия
Игла для зонда	Гарвардский аппарат; Холлистон, Массачусетс	75-0286 (Английский	перфузия
Перфузионный насос Masterflex	Коул-Пармер; Вернон Хиллз, Иллинойс	7524-10	перфузия
Силиконовые трубки Masterflex, отверждаемые платиной	Коул-Пармер; Вернон Хиллз, Иллинойс	96410-15	перфузия
Формалин (10% буферный раствор; 4 л)	Сигма-Олдрич; Сент-Луис, Миссури	HT501128	перфузия
сахароза	Сигма-Олдрич; Сент-Луис, Миссури	С0389	Криозащита