$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Запись патч-клэмпинга целой клетки
- Перенесите первый срез ткани в записывающую камеру, погруженную в непрерывный поток раствора Кребса. Установите секцию с помощью легких грузов и погрузите объектив в воду.
- Определите полосатую область в микроскопе и выполните поиск GFP-положительных (перепрограммированных) нейронов. Выберите нейрон, который обширен по морфологии и не покрыт пучками волокон или кровеносными сосудами.
- Подготовьте пипетки из боросиликатного стекла (3–7 МОм) к заплатке и залейте следующим внутриклеточным раствором (в мМ): 122,5 глюконата калия, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3 Na3GTP и 8 NaCl, отрегулированным до pH 7,3 с помощью KOH.
- Подложите стеклянную пипетку к записывающему электроду и опустите ее в раствор. Еще раз проверьте сопротивление электрода. Затем медленно приближайтесь к ячейке с помощью пипетки, сохраняя небольшое положительное давление на электрод, чтобы избежать закупоривания наконечника.
осторожность: Будьте осторожны, чтобы следить за своей ячейкой во время спуска электрода и не отбеливать флуоресценцию в ячейке (т. е. выключайте люминесцентную лампу, когда она вам не нужна).
- Осторожно промойте окружающие ткани с помощью положительного давления электрода и подойдите электродом к ячейке. Расположите электрод прямо на верхней части ячейки и опускайтесь до тех пор, пока электрод не коснется мембраны. Сделайте уплотнение Giga-Ω между электродом и клеточной мембраной и с помощью импульсов отрицательного давления разорвите мембрану, чтобы создать целоклеточный пластыр><ь.
осторожность: Перепрограммированные нейроны чувствительны. Будьте осторожны при наложении повязки и не оказывайте слишком большого отрицательного давления при достижении уплотнения Giga-Ω или вскрытии клеточной мембраны. Кроме того, наложение повязки на пожилых животных требует практики и терпения, поскольку их соединительная ткань толще, и визуализировать нейроны сложнее.
- Проверьте потенциалы мембраны покоя сразу после обкатки в режиме токо-зажима и запишите их для анализа.
- В токовом зажиме поддерживайте напряжение ячейки в диапазоне от -60 мВ до -80 мВ и подавайте токи 500 мс в диапазоне от -20 пА до +90 пА с шагом 10 пА для индуцирования потенциалов действия.