Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка животного к визуализации
- Поместите в операционную область стерильную марлю, ватные палочки и автоклавные хирургические инструменты. Включите стерилизатор микрошариков для межоперационной стерилизации хирургических инструментов.
- Обезболивание мышей (самцов или самок, 1,5–2,5 месяца, 20–25 г) путем внутрибрюшинного введения (в/в) смеси кетамина (17,2 мг/мл), ксилазина (0,475 мг/мл) и ацепромазина (0,238 мг/мл) (6 мкл/г массы тела). Подождите, пока не будет достигнута надлежащая глубина анестезии, когда животное перестанет реагировать на раздражитель с ущипыванием пальца ноги и у него не будет роговичного рефлекса. Во время операции дайте бустерную дозу в размере 1/3 от первоначальной дозы анестезирующего коктейля по мере необходимости для поддержания исходного состояния анестезии.
- Перед операцией бупренорфин следует вводить подкожно (/к; 0,05–0,10 мг/кг) в качестве обезболивающего средства. Нанесите защитную мазь на глаза животного, чтобы предотвратить пересыхание роговицы и образование катаракты.
- Поместите трансгенную мышь GCaMP6s на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение, и накройте ее стерильной хирургической простыней. Стабилизируйте голову животного с помощью адаптера для удержания головы мышей.
- Побрейте голову на большей части кожи головы с помощью лезвия бритвы с обоюдным лезвием. Очистите операционную область стерильной спиртовой салфеткой, а затем раствором повидон-йода.
2. Хроническая подготовка черепных окон
- Сделайте прямоугольный разрез кожи головы (2 мм х 3 мм) ножницами с одной стороны (справа) черепа. Отодвиньте кожу ватным тампоном, чтобы создать зону воздействия диаметром >3 мм (рисунок 1A). Удалите соединительную ткань, прикрепленную к черепу, аккуратно соскоблив череп тупым микрохирургическим лезвием (Скальпельное лезвие #10; Рисунок 1С).
- Отметьте область S1, аккуратно нарисовав круг (диаметр 3 мм, координация центра: -1,5 мм от брегмы и 2,5 мм от средней линии) на черепе с помощью стоматологической бормашины (рисунок 2B).
- Проделайте ту же процедуру с левым черепом (рисунок 2B).
- Нанесите тонкий слой цианоакрилатного суперклея на кость, чтобы обеспечить основу для нанесения стоматологического цемента.
- Под препарирующим микроскопом проуздайте круглую канавку в черепе вокруг области S1 с помощью высокоскоростного микросверла (рис. 1D). Цель состоит в том, чтобы создать ровный край для размещения на нем оптического окна.
- Многократно наносите искусственную спинномозговую жидкость (ACSF, комнатной температуры) на череп периодически в процессе истончения, чтобы облегчить сверление и рассеять тепло. Выполняйте сверление с перерывами, чтобы избежать перегрева, вызванного трением. Отсосите костные остатки с помощью домашней вакуумной линии или вакуумного насоса.
- После того, как примерно на 2/3 глубина кости просверлена, медленно и осторожно утончите оставшуюся 1/3 кости до тех пор, пока круглый кусок черепа (костный лоскут) полностью не освободится от окружающего черепа.
- Медленно и осторожно снимите круглый костный лоскут с помощью щипцов #5/45 и обнажите твердую мозговую оболочку (Рисунок 2C; Рисунок 1E).
- Поддерживайте открытую область мозга влажной с помощью ACSF (Рисунок 1E). Избегайте повреждения пиальных сосудов, так как кровоизлияние изменит мозговой кровоток, ускорит отек мозга и серьезно ухудшит качество визуализации.
- Проделайте ту же процедуру на левой (контралатеральной) стороне черепа.
- Для сборки оптического окна используйте оптический клей для клея и отверждения между слоями покровного стекла по одному. При необходимости прогрейте оптическое окно (50 °C в течение 12 часов) в инкубаторе для усиления адгезионного соединения. Оптическое окно состоит из 2 частей: верхняя часть содержит одно круглое защитное стекло диаметром 5 мм и нижняя часть содержит 1–3 круглых защитных стекла диаметром 3 мм (рис. 2D).
- Храните оптическое окно в этаноле (70%, об/об.) и промойте его стерильным физиологическим раствором перед использованием. Перед установкой оптического окна проверьте оптическое окно на наличие дефектов, в том числе неправильного количества оптического клея или неточной юстировки под стереоскопом.
- Установите оптическое окно над областью трепанации черепа (рисунок 2D). Верхняя часть оптического окна опирается на череп, а нижняя часть оптического окна входит в краниотомизированное отверстие и опирается на твердую мозговую оболочку в присутствии спинномозговой жидкости (рис. 2D, E).
- Приклейте верхнюю часть края оптического окна к черепу с помощью суперклея Cyanoacrylate Super Glue (Рисунок 2F; Рисунок 1F).
- Когда цианоакрилатный суперклей высохнет, нанесите черный стоматологический цемент (Dentsply), чтобы покрыть край стекла. Нанесите стоматологический цемент на все открытые края черепа и раны, чтобы блокировать свет (Рисунок 2G-H; Рисунок 1B).
- Проделайте ту же процедуру с левой стороны.
- Дайте животному восстановиться на грелке и верните животное в домашнюю клетку для восстановления под соответствующим контролем. Обеспечьте вас влажным кормом, чтобы облегчить жевание и увлажнение. Для уменьшения боли вводите бупренорфин.к. (0,05–2,0 мг/кг) каждые 8–12 ч после травмы в течение 2 дней. Дайте мыши восстановиться еще 7–10 дней перед созданием образа.
